Wnt signaling.

Presentazione sul tema: "Wnt signaling."— Transcript della presentazione:

1 Wnt signaling

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3 Gsc attiva le proprietà di migrazione delle cellule del labbro dorsale del blastoporo (embolia ed estensione convergente) ed attiva geni fondamentali per la formazione del mesoderma anteriore ed ectoderma encefalico presuntivo. Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

4 La massima espressione di gsc viene indotta nell’organizzatore dal centro di Nieuwkoop. gsc attiva geni che determinano movimenti di embolia ed estensione convergente delle cellule del labbro dorsale del blastoporo. Iniezione di gsc mRNA nei blastomeri vegetativi ventrali allo stadio di 16 cellule determina un secondo labbro dorsale e di conseguenza un secondo asse.

5 Stage-35 embryos injected at the 4-cell stage in a single ventral blastomere with 250 pg of β-catenin RNA alone (A) or in combination with 250 pg of ΔN-Tcf3 RNA (B).

6 (A–D) Embryos allowed to develop until sibling stage 27
(A–D) Embryos allowed to develop until sibling stage 27. Anterior is to the left. (A) shows phenotypes of embryos injected with 250 pg of ΔN RNA in both dorsal blastomeres at the 4-cell stage. (B) shows a horizontal section of an embryo as in (A), with blastopore to the right. (C and D) Embryos injected with a combination of 250 pg of ΔN RNA and 250 pg of β-gal RNA (C) or β-gal RNA alone (D). (E and F) In situ hybridization with goosecoid on embryos injected with 250 pg of ΔN (E) or 250 pg of β-gal (F) analyzed at stage 11. Dorsal view of cleared embryos with the dorsal blastopore lip to the bottom. Some nonspecific staining occurs in the blastocoel cavity in (E).

7 centro di Nieuwkoop

8 ODC (ornitina decarbossilasi) viene usata come controllo.
Analisi d’espressione a vari stadi di sviluppo mediante RT-PCR. Gli Xnr (nodal related) sono induttori del mesoderma e vengono espressi in modo temporalmente specifico. ODC (ornitina decarbossilasi) viene usata come controllo. (Nieuwkoop and Faber, 1994). Agius et al., Development 127 (2000)

9 Agius et al., Development 127 (2000)
Endogenous Xnrs are expressed at the right time and place to function as mesoderm inducers. Dissections of embryos at stage 9 showing that Xnr1, Xnr2 and Xnr4 are expressed in the endoderm and at higher levels dorsally than ventrally. Vg1 is expressed uniformly in the vegetal pole. Agius et al., Development 127 (2000)

10 V D Exp di Nieuwkoop ripetuti utilizzando inibitore* dei fattori nodal-related (che NON inibisce Vg1, VegT, activina): nessuna induzione del mesoderma *Cer-S = Cerberus-short, frammento C-terminale di Cerberus, fattore secreto che inibisce l’induzione del mesoderma da parte dei nodal-related

11 Concentrazione intermedia Mesoderma laterale
VegT+Vg1+b-catenina sinergizzano per attivare i geni Nodal-related. Poiché VegT e Vg1 sono localizzati ventralmente e b-catenina solo dorsalmente, si instaura un gradiente di segnale Nodal Concentrazione intermedia Mesoderma laterale Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005, Agius et al., Development 127 (2000)

12 Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S. p. A
Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

13 Il labbro dorsale di tritone induce strutture neurali nel tessuto ectodermico.
gsc attiva fattori solubili necessari alla determinazione degli assi.

14 noggin La prima delle molecole solubili secrete dall’organizzatore (noggin) viene individuata da Smith e Harland (1992). Anzitutto trattano embrioni di Xenopus con Cloruro di Litio (LiCl) in modo da ottenere gastrule dorsalizzate (il LiCl aumenta l’area del mesoderma organizzatore nella zona marginale inibendo GSK3) allo scopo di aumentare la frazione degli mRNA dei geni dell’organizzatore rispetto al totale degli mRNA. Quindi costruiscono una libreria plasmidica di cDNA, dalla quale sintetizzano cRNA che vengono iniettati in embrioni irradiati con UV (quindi, ventralizzati). I messaggeri in grado di restituire agli embrioni ventralizzati l’asse dorsale codificano per i fattori d’interesse.

15 noggin [mRNA noggin] UV

16 Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, 2005
noggin Noggin induce l’ectoderma dorsale a divenire tessuto neurale ed è in grado di conferire destino dorsale a cellule mesodermiche che altrimenti andrebbero incontro a destino ventrale. Noggin lega BMP2 e BMP4, impedendo loro di legarsi ai recettori. visione dorsale visione laterale Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, 2005

17 chordin + nodal-related 3
pre-gastrulazione gastrulazione Chordin è stato isolato da embrioni dorsalizzati (assente in embrioni ventralizzati) per la sua capacità d’indurre assi secondari quando iniettato nei blastomeri ventrali. Si esprime nel labbro dorsale del blastoporo e, successivamente, nella notocorda. Deplezione di Chordin mediante oligonucleotidi antisenso morpholino causa assenza del Sistema Nervoso Centrale in Xenopus. Come Noggin, anche Chordin lega BMP2 e BMP4 impedendo loro di interagire coi recettori. Nodal-related 3 (Xnr-3) agisce in modo analogo a Noggin e Chordin. Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, 2005

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19 follistatina Hemmati-Brivanlou e Melton generano un dominante negativo per il recettore dell’activina (allo scopo di bloccarne il pathway) che iniettano nell’embrione di Xenopus. Risultato: tutto l’ectoderma diventa tessuto neurale (Hemmati-Brivanlou & Melton, 1997). Modello della Neurulazione per Difetto: l’organizzatore produce inibitori degli induttori dell’epidermide. Quindi, la condizione di base dell’ectoderma è neurale, mentre l’epidermide deve venire indotta. Bloccando l’induttore l’ectoderma evolve in neurale. La follistatina si lega, bloccandola, all’activina (o a molecole simili). La follistatina è espressa nel labbro dorsale del blastoporo e nella notocorda.

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21 noggin-chordin-foll. vs. BMP4
Noggin, cordina e follistatina sono tutte e tre espresse dall’organizzatore. Tali molecole sono in effetti in grado di interagire con BMP4 (bone morphogenetic protein 4 – proteina morfogenetica dell’osso 4). A seguito di tale interazione, l’effetto induttivo di BMP4 viene bloccato. Effetto induttivo BMP4? Iniezione di mRNA codificante BMP4 in uova di Xenopus determina il (1) differenziamento di tutto il mesoderma embrionale verso un destino ventro-laterale. (2) Inoltre, non si attua embolia a livello del blastoporo. Blocco di BMP4 (espressione del recettore dominante negativo) determina (1) la formazione di un secondo asse dorsale. BMP4 induce l’ectoderma a formare epidermide

22 Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S. p. A
Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

23 noggin-chordin-foll. vs. BMP4
Nelle blastule in stadio avanzato, BMP4 (potente fattore ventralizzante) è espresso in tutta la regione ectodermica e mesodermica. In gastrulazione, l’organizzatore esprime il fattore di trascrizione iro1, che reprime l’espressione di bmp4, che risulta quindi ora espresso solo nella zona marginale latero-ventrale. Inoltre, la produzione di Noggin, cordina e follistatina da parte dell’organizzatore determina il blocco funzionale di BMP4 secondo un “gradiente” degli inibitori (blocco totale in prossimità dell’organizzatore, assenza di blocco nella regione ventrale).

24 Xolloid: metalloproteasi che degrada Chordin
Gilbert, BIOLOGIA DELLO SVILUPPO, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

25 BMP4 [BMP4 attiva] GENI ATTIVATI myf5 vent2 vent1, vox TESSUTO INDOTTO
Notocorda Muscolatura dorsolaterale Mesoderma ventro-laterale Mesoderma ventrale, epidermide [BMP4 attiva]

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27 regionalizzazione L’organizzatore (i)induce il tubo neurale e (ii)ne specifica le varie regioni