CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008

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1 CORSO DI BIOLOGIA CELLULARE e MOLECOLARE 2008
TRASFEZIONE GENICA

2 TRASFEZIONE GENICA Trasferimento di DNA esogeno in cellule di mammifero per lo studio della funzione e dei meccanismi di controllo dei GENI

3 Perché trasferire nelle cellule frammenti di DNA esogeno?
IN RICERCA: a) cellule in coltura Identificazione di sequenze regolatorie Struttura e funzione genica Produzione di proteine Studio Farmaci b) IN VIVO: produzione di animali transgenici Modelli per la comprensione delle basi molecolari di malattie umane IN PRATICA CLINICA: TERAPIA GENICA Ripristino di funzioni metaboliche deficitarie Aumento delle difese naturali

4 Il trasferimento genico
Tipi cellulari: Non tutte le cellule possono essere trasfettate con successo Processo in sé inefficiente Necessaria una fonte abbondante di cellule di partenza per ottenere un numero utilizzabile di cellule trasfettate Linee cellulari immortalizzate - Crescita in medium chimicamente definito per tempo indefinito - Rapida duplicazione

5 Corte sequenze nucleotidiche Danno inizio alla trascrizione
MCS Vettore PLASMIDE VIRUS (infezione) Promotore: Corte sequenze nucleotidiche Danno inizio alla trascrizione Enhancer: elementi di regolazione positiva Derivati da virus SV40 early gene enhancer: attivo su molti tipi cellulari LTR: long terminal repeat Raus Sarcoma Virus CMV Silencer: elementi di regolazione negativa Fattori per la replicazione: cis, trans ORI: sito di inizio della trascrizione (in genere SV40)

6 Che tipo di trasfezione?
TRANSIENTE: - per esperimenti a breve termine (analisi ICC, studio del promotore…) - le cellule sono normalmente raccolte h dopo la trasfezione - over-espressione genica - popolazione cellulare disomogenea: poche cellule con molto plasmide - immediata STABILE: - per esperimenti a lungo termine  possibilità di isolare e propagare singoli cloni contenenti il DNA trasfettato - il plasmide si integra nel genoma, processo lungo e laborioso - l’integrazione è casuale - necessario marker di selezione (morfologia, resistenza a sostanze…) - popolazione cellulare omogenea: molte cellule con poco plasmide

7 Scopo della trasfezione
Indagini sulla funzionalità di un gene PROMOTORE STD + GENE D’INTERESSE Controllo dell’espressione genica: indagini sulla regolazione del promotore PROMOTORE DEL GENE D’INTERESSE + GENE REPORTER

8 2. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless
Studio attività-funzione di una proteina - promotore forte, cellula-specifico + gene per quella proteina 2. Studi di attività trascrizionale: vettore promoterless Promotore con inserzione + reporter Enhancer + Promotore + reporter Promotore deleto + reporter Promotore + reporter

9 GENE REPORTER: permette immediata identificazione delle cellule positivamente trasfettate
Mk di selezione: Crescono solo le cellule che hanno acquisito il vettore Creazione di linee stabili Reporter : Le cellule con il vettore acquisiscono particolari caratteristiche Funzionalità di un promotore: reporter posto sotto il controllo di quel promotore Funzionalità di un gene: Fusione del gene d’interesse con il gene reporter Entrambi posti sotto la regolazione dello stesso promotore

10 Caratteristiche di un reporter
non deve avere un’attività proteica SIMILE a quella del gene d’interesse l’attività proteica del Reporter non deve INTERFERIRE con quelle fisiologiche della cellula: le vie di segnalazione e il metabolismo cellulare devono rimanere integri il saggio sull’attività del reporter deve essere specifico, riproducibile e immediato

11 geni reporter Cloramfenicolo acetil-transferasi:
Enzima batterico: resistenza all’antibiotico cloramfenicolo Acetilazione del Cloramfenicolo Se si usa come substrato l’antibiotico marcato con C14, viene acetilato solo nelle cellule trasfettate e dove il promotore che controlla l’enzima è attivo. Si produce una miscela di molecole marcate rilevate su TLC o autoradiografia Esempio: ANALISI TLC IL Clone A non ha attività acetilasica I Cloni B e C hanno attività acetilasica clone A clone B clone C

12 geni reporter ß-galattosidasi: Codificato dal gene LacZ di E.coli
Conversione di alcune sostanze in composti colorati Citochimica: clivaggio del substrato XGal → comparsa di precipitati BLU (colonie blu) Spettroscopia: clivaggio di ONPG (o-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside ) → composto solubile giallo Luciferasi: luciferina + ATP luciferil adenilato + PPi luciferil eadenilate + O2 ossiluciferina + AMP + LUCE

13 - Dual system Firefly Luciferase Renilla Luciferase T-inducible
HSV TK promoter AR ± T Amp r R Luc+ pRL-TK plasmide PRE HSV TK promoter SV40 late poly(A) signal Amp r F Luc+ ori pPRE-TK-luc reporter plasmide SV40 late poly(A) signal YY reagent ori Firefly Luciferase inhibition Renilla Luciferase - XX reagent T-inducible luminescence constitutive luminescence Dual system

14 geni reporter GFP: green fluorescent protein
espresso nella medusa Aequorea Victoria in natura produce bioluminescenza dovuta al trasferimento di energia (processo Ca-dipendente associato alla proteina Aeqorina) l’esposizione della proteina a raggi ultravioletti produce autofluorescenza di colore verde in assenza di Ca, Aequorina o qualunque cofattore o substrato mutazioni puntiformi nel cromoforo producono varianti che emettono luce a differente lunghezza d’onda CFP (cyan, colore blu) YFP (yellow, colore giallo)

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16 Sito di poliadenilazione
RNApolII trascrive anche il sito di poliadenilazione, parte della porzione 3' viene rimossa e l'RNA poliadenilato. Le sequenze downstream devono essere incluse nei vettori di espressione degli eucarioti per avere la sintesi di mRNA Due elementi indispensabili per corretta POLIADENILAZIONE sequenze ricche di GU o U downstream il sito di poliadenilazione; sequenze di 6 nucleotidi AAUAAA localizzate nucleotidi upstream il sito di poliadenilazione

17 Clonaggio di un gene in un vettore

18 METODI DI TRASFEZIONE CARATTERISTICHE: Elevata efficienza
Bassa tossicità Riproducibilità in vitro e in vivo PROCESSO: Introduzione del DNA nella cellula Ottenimento dell’espressione del gene d’interesse (selezione delle cellule che si sono trasfettate stabilmente) Caratterizzazione del gene/ proteina prodotta PROBLEMATICHE: Come superare le barriere naturali??? DNA: fortemente POLARE (carica negativa) MEMBRANA CELLULARE LIPOFILA

19 METODI DI TRASFEZIONE METODI CHIMICI METODI FISICI

20 Metodi chimici CALCIO FOSFATO
Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule Gli ioni bivalenti possono promuovere l’ingresso di acidi nucleici attraverso le membrane. • VANTAGGI • Economico • Relativamente versatile • SVANTAGGI Tecnicamente delicato - forma e dimensioni del precipitato - influenzato da variazioni anche minime di pH Efficienza bassa Elevata Citotossicità Non funziona con alcuni tipi cellulari

21 Metodi chimici DEAE-DESTRANO:
il primo metodo usato per l’introduzione di DNA nelle cellule eucariote DESTRANO: Polisaccaride costituito da unità di D-glucosio legate mediante legami di tipo alfa1/4 o alfa1/6. Quando viene associato a gruppi carichi positivamente DEAE (dietilamminoetile) è in grado di legare il DNA e di mediarne l’ingresso attraverso le membrane. Le cellule vengono trattate con glicerolo o DMSO (shock osmotico) VANTAGGI Molto semplice SVANTAGGI Molto poco efficiente Solo transfezioni transienti

22 Metodi chimici LIPOSOMI:
misto di lipidi policationici e neutri, permette la formazione di vescicole liposomiali unilamellari che portano una carica netta positiva La testa cationica del composto lipidico si associa ai gruppi P negativi dell’acido nucleico I complessi lipidi- DNA si fondono con le membrane cellulari e rilasciano spontaneamente il loro contenuto nelle cellule VANTAGGI: Bassa tossicità SVANTAGGI Difficile produrre liposomi Alta variabilità

23 Esempio: LIPOFECTAMINA
I lipidi cationici formano dei liposomi, con una superficie carica positivamente che consente l’associazione del DNA e media l’interazione con la membrana plasmatica (carichi negativamente) Molecole formate da una coda policationica (DNA) e da una porzione lipidica (membrana) VANTAGGI Semplice Efficiente Poco tossico SVANTAGGI Condizionato dalla presenza di siero o antibiotici

24 Esempio: LIPOFECTAMINA reagenti e metodo
Transferrina Aggiunto al mix liposoma-DNA Ligando che funziona da AGENTE DIREZIONANTE, grazie alla sua affinità con recettori di membrana, facilita l’interazione e l’ingresso del complesso Non specifico (come insulina…) Reazione cellulo-specifica: Ab-Ag

25 Un giorno prima : piastratura delle cellule
Devono arrivare a una confluenza del 50-80%: ottimizzazione della densità cellulare Trasfezione Diluire il DNA in medium PRIVO di siero e antibiotici Aggiungere la Transferrina (Tf) Lasciare reagire 15 min Diluire la Lipofectamina in D-MEM privo di siero Aggiungere la Lipo al DNA+Tf Cambio medium: Eliminare dalle piastre il medium di crescita Aggiungere medium privo di siero e Ab (metà del volume) Gocciolare il mix Lipo-DNA-Tf sulle cell Lasciare reagire 3h Rabboccare con D-MEM + siero (in proporzione doppia) + Ab Il giorno dopo: cambio medium e trattamenti

26 Metodi fisici ELETTROPORAZIONE:
Le cellule vengono poste in una soluzione contenente DNA, e vengono esposte ad un breve impulso elettrico che produce transitoriamente dei pori nelle loro membrane VANTAGGI Può essere utile per quei tipi cellulari in cui non si ottengono risultati con i metodi classici Il DNA entra direttamente senza passare attraverso il compartimento endosomiale dove può aver luogo la degradazione dell’acido nucleico SVANTAGGI Necessità di ottimizzare le condizioni del campo elettrico -intensità e durata- Elevato livello di tossicità (50%)

27 Metodi fisici MICROINIEZIONE:
il DNA viene inserito nella cellula -nel citoplasma o nel nucleo- attraverso un capillare di vetro, con un sistema ad alta pressione. Date le ridotte dimensioni delle cellule (alcune decine di mm di diametro) la microiniezione richiede una sofisticata apparecchiatura che comprende: • un microscopio, • un micromanipolatore • un iniettore VANTAGGI effettuare il trasferimento selettivamente nel citoplasma o nel nucleo aumenta efficienza di espressione modulare facilmente il livello di espressione SVANTAGGI Tecnicamente impegnativa Poche cellule alla volta COSTOSO

28 Metodi fisici GENE GUN:
Usa una pressione regolabile ad elio per sparare microcarriers d’oro rivestiti di DNA sulla parete interna di una cartuccia di plastica direttamente sul bersaglio Sistema per accelerare microproiettili d’oro o di tungsteno rivestiti di DNA su un bersaglio posto in una camera sottovuoto VANTAGGI Possibilità di lavorare in situ Applicabile a quei sistemi cellulari poco responsivi ad altri carrier per il trasferimento genico anche in vivo Possibilità di fare studi di espressione genica in condizioni fisiologiche: espressione tessuto specifiche studi sullo sviluppo Possibilità di usare meno DNA e meno cellule di partenza SVANTAGGI Trattamento invasivo Efficienza fortemente dipendente dal tipo cellulare Molti parametri da controllare COSTOSO

29 OTTIMIZZAZIONE DEL PROCESSO
DNA da trasfettare Privo di contaminanti: proteine/ RNA Soluzione sterile TIPO DI CELLULE TIPO DI VETTORE Adatto per aumentare l’espressione in linee cellulari di mammifero TEMPO DI TRASFEZIONE Da 30 min a 4 ore TIPO DI TERRENO DI COLTURA Effetto di siero e antibiotici

30 APPLICAZIONI SILENZIAMENTO GENICO SISTEMI INDUCIBILI

31 1) RNA interference (RNAi):
processo post-trascrizionale presente in molti organismi e tipi cellulari mediato da corte molecole di RNA (‘short interfering RNA’ o siRNA) provocano degradazione dell’mRNA con sequenza complementare --> “silenziamento” gene-specifico scoperti altre forme di RNA silenziatori: microRNA esistono forme endogene e forme esogene endogeni: sintetizzate molecole di preRNAi da trascrizione di geni nucleari “non-protein-coding-genes”, servono per regolazione fine del ‘pool’ proteico in ogni fase del ciclo cellulare e ruolo in funzioni biologiche (difesa antivirale, silenziamento dei centromeri, riarrangiamenti cromosomici e silenziamento “trasposoni”) esogeni: molecole potenzialmente dannose provenienti da fasi d’infezione virale o frammenti di RNA di sintesi chimica, iniettati nella cellula sfruttati in ricerca e come potenziali agenti terapeutici

32 Small interfering RNA (siRNA):
“silenziatori genici” originano da molecole dsRNA più lunghe rascritte da geni codificanti per prodotti non proteici nel citoplasma dsRNA vengono riconosciuti da Dicer (complesso multienzimatico con attività RNAsi III simile) si originano frammenti di nt, i siRNA a doppio filamento siRNA-ds vengono inglobati in complesso ribonucleoproteico RISC (RNA-Induced Silencing Complex) attivato dallo svolgimento della doppia elica di siRNA RISC attivo riconosce mRNA con sequenza perfettamente complementare alla sequenza del siRNA legato degradazione mRNA e conseguente --> ‘silenziamento sequenza-specifico’

33 microRNA (miRNA): piccole molecole non codificanti di RNA
RNA a singolo filamento di basi conservati durante l’evoluzione, identificati in diversi organismi tra cui uomo, nematodi, moscerino della frutta e piante originano da lungo dsRNA, processati da Dicer che utilizza precursori di basi a forma di ‘forcina’ (hairpin) miRNA di basi vengono legati da un complesso simile a RISC specificità d’appaiamento enzima-miRNA e mRNA target determina destino target: a) poco specifico: legame tra miRNA e target avviene al 5’UTR del mRNA --> non si lega apparato traduzionale ma mRNA non viene degradato b) altamente specifico: mRNA viene degradato numero di geni target dei miRNA è maggiore di quello dei siRNA

34 STRATEGIE SPERIMENTALI:
APPLICAZIONI: controllo mirato e studio dell’espressione genica: è infatti possibile spegnere geni specifici sia in colture cellulari che in modelli animali applicazioni anche nelle analisi di genomica funzionale applicazioni di tipo terapeutico: inibire oncogeni correlati a tumori prodotti in seguito a traslocazioni cromosomiche o mutazioni puntiformi. inibizione della replicazione virale in colture cellulari. STRATEGIE SPERIMENTALI: a differenza di quanto accade per le celule vegetali, in C. elegans e in Drosophila, nelle cellule animali l’ingresso di dsRNA di lunghezza maggiore di 30 nt può scatenare un processo di degradazione del filamento medesimo (meccanismo di difesa della cellula contro frammenti di genoma virale). quindi si utilizzano direttamente i siRNA (dsRNA di l<25nt) che vengono direttamente assemblati nel complesso RISC. siRNA possono essere: sintetizzati chimicamente trascritti in vitro e poi introdotti nella cellula mediante trasfezione iniettati in topi o inseriti in piante modificazione della tecnica: RNA interference DNA diretta (ddRNAi)

35 ddRNAi: permette uso di RNAi per silenziamento genico a scopo terapeutico e per lo screening di interi genomi si basa su: a) azione di promotori per l’RNA pol III e per RNA pol II per l’espressione di specifiche sequenze di siRNA trasfettate in cellule di mammifero  permette di utilizzare DNA templati che permettono la sintesi di dsRNA corti in vivo, strutturalmente equivalenti ai siRNA attivi sintetizzati in vitro b) in alternativa si può usare uno ‘short hairpin RNA’ (shRNA), cioè RNA costituito da sequenza omologa a mRNA da silenziare, un loop, ripetizione invertita della sequenza target

36 2) I sistemi inducibili permettono di regolare l’espressione di un gene richiedono espressione stabile del gene che si vuole regolare permettono di studiare l’espressione di geni tossici: si possono ottenere linee cellulari trasfettate stabilmente col gene da studiare che viene: - mantenuto “spento” in propagazione - “acceso” al momento dell’esperimento Protocollo per una trasfezione stabile: prima della trasfezione determinare la concentrazione a cui usare l’agente selettivo è necessario trasfettare oltre al gene di nostro interesse anche il gene che conferisce la resistenza all’agente selettivo trasfettare anche cellule, come controllo, senza il gene della resistenza per circa 14 gg cambiare il medium e aspettare che muoiano le cellule non trasfettate (non resistenti) o che non hanno integrato stabilmente il plasmide (che altrimenti viene perso dopo un certo numero di divisioni). Nella coltura di controllo le cellule devono morire quando si iniziano a vedere “isole” di cellule resistenti, trasferire i singoli cloni in MW96 e continuare con lo screening

37 Geni per markers selettivi:
Il marker può essere presente sullo stesso plasmide del gene di nostro interesse oppure co-trasfettato con un secondo plasmide. timidina chinasi (Tk): enzima che permette la sintesi della timidina. Si selezionano cellule Tk- che vengono poi trasfettate con il plasmide Tk+. In un terreno –timidina crescono solo le cellule che hanno acquisito il plasmide. - sono poche le cellule Tk- e non è detto che vadano bene per il nostro studio aminoglicoside fosfotransferasi (Neo): conferisce resistenza agli antibiotici aminoglicosidici (kanamicina, neomicina, geneticina…). Questi antibiotici tendono a non essere tossici a piccole dosi, per selezionare le cellule sono necessarie dosi elevate che però possono danneggiare anche le cellule trasfettate necessario determinare la dose appropriata. igromicina B fosfotransferasi: conferisce resistenza all’igromicina (Hyg) asparagina sintetasi xantina-guanina fosforibosil transferasi

38 Lac system: sistema di repressione batterico. scoperto negli anni’50 all’Istituto Pasteur di Parigi da F. Jacob e J. Monod, studiando l’eredità dei geni che controllano il metabolismo del glucosio e di altri zuccheri in E.coli. Operone Lac: tre enzimi codificati dalla stessa unità trascrizionale lacY  permeasi necessaria per ingresso del lattosio nella cellula lacZ  beta-galactosidasi che converte lattosio in glucosio e galattosio lacA  tiogalattoside transacetilasi, non richiesta per metabolismo del lattosio Controllo da parte del repressore lac (gene lac I) separato dall’operone e sintetizzato in forma attiva; si lega sul promotore (operatore) e impedisce trascrizione dell’intero operone. lac  lacI attivo  blocco trascrizione  Gli enzimi della via metabolica non sono sintetizzati se non richiesti + lac (o analogo IPTG)  lacI viene inattivato  trascrizione dell’intero operone

39 Plasmide pGEX: contiene proteina GST con a valle un sito di taglio per la trombina regolato da promotore “tac”, promotore ottimizzato artificialmente, derivante dalla fusione del lac promoter operon con parte del promotore dell’operone trp (triptofano) Mantiene inducibilità da IPTG, ma presenta livelli di espressione assai più alti rispetto al lac normale  produzione di grosse quantità di proteina, purificabile mediante GST AD+polyQ AR GST LBD Trombine cleavage site Promotore lac

40 TROMBINA: MATRICE RESINA GLUTATIONE SEPHAROSE 4B Chimera GST-AR
Sfere di diametro µm Spaziatore di 12 atomi legato a glutatione (glicina, glutammato, cisteina) Chimera GST-AR TROMBINA: Taglio proteolitico Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser AR libero + GST legato

41 Tet system: TET-ON e TET-OFF
Sistemi regolati dalla tetraciclina (Tc) o da suoi analoghi come la doxyciclina (Dox). Tet-On: l’aggiunta di Tc o Dox accende il nostro gene Tet-Off: l’aggiunta di Tc o Dox mantiene spento il nostro gene Sistemi sfruttano le proteine di E.coli coinvolte nella resistenza alle tetracicline: Tet R= tet repressor protein: regola negativamente l’espressione dei geni coinvolti nella resistenza (trasposone Tn10). In assenza di Tc, Tet R si lega alla sequenza Tet O=tet operator e blocca la trascrizione. Per gli exp in cell di mammifero Tet R è stata modificata: - tTA= Tc-controlled trans activator: proteina ibrida (37 kDa) ottenuta dalla fusione dei primi 207 aa di Tet R con 127 aa del C-ter dell’activator domain VP16 di herpes simplex virus diventa attivatore trascrizionale in presenza di Dox - rtTA= reverse tTA: proteina ottenuta modificando 4 aa di Tet R; ha comportamento opposto a tTA in risposta a Dox

42 TET-ON  rtTA TET-OFF  tTA
Il gene che vogliamo regolare deve essere inserito a valle di una sequenza TRE= Tc responsive elements, sequenze di 42 bp che contengono sequenza Tet O. L’espressione basale del promotore è molto bassa in assenza di Tc.

43 Tet-On vs Tet-Off: I due sistemi sono complementari.
nel sistema Tet-Off è necessario aggiungere Tc o Dox nel medium per mantenere lo stato inattivo. Le due molecole però hanno emivita breve ed è quindi necessario aggiungerle ogni circa 48 h per reprimere l’espressione del gene X. il sistema Tet-On è responsivo solo alla Dox, mentre Tet-Off è sensibile a entrambi. le concentrazioni di Tc o Dox necessarie sono molto basse, inferiori a dosi citotossiche (sia per colture cellulari che per animali transgenici) in entrambi i casi sono necessarie due trasfezioni stabili consecutive: il plasmide regolatore e successivamente pTRE-gene X

44 1^trasfezione stabile:
piastrare cell e lasciarle crescere fino a circa 80% di confluenza trasfezione con vettore pTet On/Off plasmide può essere linearizzato per aumentare efficienza di integrazione permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e quindi aggiungere agente selezionante (G418, ug/ml) cambio medium ogni 48 h o quando necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole colonie e trasferire ognuna in una well screening: trasfezione con plasmide reporter, ex: pTRE-luc che contiene gene per la luciferasi di lucciola regolato da sequenza TRE selezione delle colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto) congelare stock dei cloni positivi

45 Trasfezione transiente preliminare:
I cloni stabili positivi ottenuti nella 1^trasfezione vengono trasfettati in transiente con il plasmide pTRE-gene X per verificare l’effettiva regolazione genica sul costrutto che si vole trasfettare stabilmente. L’analisi della regolazione può essere effettuata con diverse tecniche: - Western Blot - RT-PCR -saggio funzionale per la proteina X - […]

46 2^trasfezione stabile:
piastrare cell stabili per pTet On/Off e lasciarle crescere fino a circa 80% di confluenza Co-trasfezione con vettore pTRE-gene X e pTk-Hyg (10:1). I plasmid pòssono essere linearizzati per aumentare efficienza di integrazione permettere a cell di duplicarsi (24-48 h) e quindi aggiungere agente selezionante (igromicina B, ug/ml) e Dox nel caso del sistema Tet-Off cambio medium ogni 48 h o quando necessario. Dopo circa 5 gg le cellule che non hanno preso la resistenza iniziano a morire dopo circa 2-4 week iniziano a comparire le colonie singole. Isolare le singole colonie e trasferire ognuna in una well screening: verificare espressione gene X, utilizzare la stessa tecnica usata nel controllo della trasfezione transiente selezione delle colonie migliori (maggior differenza indotto-non indotto) congelare stock dei cloni positivi

47 lo scopo è quello di generare una linea stabile che abbia un basso background e alti livelli di espressione della proteina X quando indotta (differenza di almeno 20 volte) livelli di espressione e induzione possono risentire del sito d’integrazione (ex: se integrazione avviene vicino a degli enhancer si può avere un aumento del livello di espressone basale). Per questo motivo è meglio screenare il maggior numero di colonie possibili per identificare quelle con le migliori caratteristiche se il plasmide pTRE non contiene un marker di selezione è necessaria co-trasfezione ad ex con plasmide pTk-Hyg. pTRE-gene X: pTk-Hyg 10/20:1 per aumentare probabilità che vengano acquisiti entrambi i vettori dalla cell e non solo quello della resistenza

48 esempio: NSC34-Tet Off