Ingegneria animale e animali transgenici

Presentazione sul tema: "Ingegneria animale e animali transgenici"— Transcript della presentazione:

1 Ingegneria animale e animali transgenici
Alessia Stell Adriana Maggi Lab 2 Dicembre 2010 Ingegneria animale e animali transgenici

2 Manipolazione genetica tradizionale

3 Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE

4 Cosa mancava per passare dalla manipolazione genetica tradizionale a quella moderna?
1967: Scoperta della DNA ligasi 1968: Scoperta degli enzimi di restrizione 1972: Avanzamenti nelle tecniche di trasferimento del DNA e nell’uso di plasmidi

5 Animale Transgenico: animale nel cui genoma è stato inserito uno o più frammenti di DNA esogeno
Transgene: frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

6 Metodi di Ingegneria animale

7 Sono 3 i metodi principali di ingegneria animale
Transgenesi standard 1 Gene Targeting 2 Clonazione 3

8 Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata
Transgenesi standard 1 Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata SCOPO: Guadagno di funzione CARATTERISTICA: inserzione random, casuale

9 Introduzione di una sequenza di DNA purificata in uno dei due pronuclei della cellula uovo fecondata

10 La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie

11 La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Cocktail ormonale per la superovulazione: PMS (pregnant mares serum) HCG (human chorionic gonadotropin) Raccolta degli oociti fecondati Accoppiamento ♀ ♀ ♀ ♂

12 La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Costruzione del transgene Amplificazione del transgene Purificazione del transgene

13 La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Accoppiamento delle femmine con maschio vasectomizzato Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida ♀ X ♀ pseudogravida ♂ vasectomizzato

14 La procedura per ottenere la transgenesi standard si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione degli oociti fecondati 2. Preparazione dei costrutti 3. Preparazione delle femmine “pseudogravide” 4. Screening della progenie Estrazione DNA dalle code della progenie Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot M C C

15 L’inserzione del transgene è casuale
RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA Non si sa dove si è localizzato il transgene; Non si può regolare il numero di copie introdotte nel pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per l’integrazione; Guadagno di funzione o perdita di funzione? “Incrociamo le dita!!”

16 Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells
Gene Targeting 2 Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells SCOPO: Perdita o modifica di funzione CARATTERISTICA: inserzione mirata

17 La RICOMBINAZIONE OMOLOGA è il meccanismo che permette il gene targeting
AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA X X AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA Gene inattivo

18 La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie

19 La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Preparazione delle ES pluripotenti dalla blastocisti Preparazione del transgene Sequenze di ricombinazione Omologa Neor – resistenza alla Neomicina Tk - thymidine kinase Gene non attivo Elettroporazione

20 La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Trattamento con neomicina e ganciclovir No integrazione X Gene non attivo Sequenze di ricombinazione Omologa Integrazione sito-specifica (1/1000) Tk - thymidine kinase Neor – resistenza alla Neomicina Integrazione random X

21 La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie ES inserite in una blastocisti di topo nero

22 La procedura per ottenere il gene targeting si basa su 4 fasi distinte
1. Preparazione delle ES cells pluripotenti e trasfezione 2. Selezione delle ES 3. Iniezione delle ES trasfettate in una nuova blastocisti 4. Screening della progenie Topo “chimera”

23 L’inserzione del transgene è mirata
RICOMBINAZIONE OMOLOGA Si conosce la localizzazione genica dell’inserimento del transgene; Problemi: espressione tempo e spazio specifica? “Obiettivo raggiunto!”

24 Clonazione 3 Trasferimento del nucleo di una cellula somatica in un oocita anucleato SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse

25 I Cloni vengono ottenuti attraverso Somatic Cell Nuclear Transfer

26 Il materiale genetico viene copiato in toto
Nuclear Transfer Le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo possono essere ingegnerizzate prima del reimpianto.

27 Altre tipologie di Ingegneria animale

28 Altre tecniche, oltre a quelle classiche, sono state sviluppate in ingegneria animale
Knockout condizionali 1 Animali reporter 2

29 1 Knockout condizionali
Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase particolare di sviluppo SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout.

30 Il sistema Cre-LoxP è uno dei sistemi più utilizzati
La CRE è una RICOMBINASI LOXP sono le sequenze riconosciute da CRE Gene da excidere

31 Esempio: delezione di IGF-1 fegato-specifica: topi LID (liver IGF1 specific deficient)
Esone 4 Cre X LoxP Promotore dell’albumina X CRE CRE 80% IGF-I plasmatico

32 Animali reporter 2 Inserimento di un gene codificante una proteina facilmente identificabile e rilevabile SCOPO: la proteina reporter dà informazioni rapide e dinamiche sugli eventi molecolari che si vogliono studiare

33 La luciferasi è uno dei geni reporter più utilizzati nei topi
Sequenze regolatorie Gene ESOGENO Emivita breve Facilmente detectabile

34 Esempio: il topo reporter ERE-Luc
MAR ERE X2 Tk Luciferasi MAR Transgene inserito nel topo ERE-Luc

35 Applicazioni pratiche dell’
Ingegneria animale

36 1 2 3 4 5 Studio di funzione genica (ricerca di base)
Transgenesi standard Gene targeting Clonaggio KO condizionale Animale reporter Studio di funzione genica (ricerca di base) 1 Modelli di patologia umana 2 Produzione di biofarmaci 3 Screening di farmaci 4 Produzione di organi per xenotrapianti 5

37 Delezione di un gene tramite gene targeting
Studio di funzione genica (ricerca di base) 1 Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard Delezione di un gene tramite gene targeting Palmiter et al, Nature, 1982

38 ESTROGEN RECEPTOR KNOCKOUT MICE
Couse & Korach, Endocrine Reviews, 1999

39 2 Modelli di patologia umana
Inserimento di gene (o boost dell’espressione di un gene) tramite transgenesi standard: Oncogeni (c-neu, c-myc, H-ras): tumori Antigeni di istocompatibilità: autoimmunità β-globina umana: talassemia Recettore LDL: aterosclerosi APP umana: morbo di Alzheimer Delezione di un gene tramite gene targeting: Apolipoproteina E: aterosclerosi Glucocerebrosidasi: malattia di Gaucher CFTR umana: fibrosi cistica […]

40 Esempio: modelli di overespressione di APP umana per lo studio della malattia di Alzheimer
Lord A, Neurobiol Aging, 2006

41 3 Produzione di biofarmaci + Emoglobina + Insulina + tPA + GH
Produzione di proteine ricombinanti biologicamente attive nella ghiandola mammaria di animali transgenici

42 Pro/contro del “biopharming”
Abbondanza: 5–10g/L al giorno paragonato ad 1 g/L delle cellule. Costo Adattabilità alle richieste Funzionalità: le proteine sono folded in maniera naturale Raccolta: facile purificazione dal latte Tempistiche: lunghi tempi per messa a punto e valudazione di animali transgenici Attesa della lattazione Inserzione casuale: può causare problemi all’animale

43 Screening di farmaci 4 L’attività del promotore è osservata in tempo reale e nel contesto fisiologico dell’intero organismo The mammary gland is the preferred production site, mainly because of the quantities of protein that can be produced in this organ using mammary gland-specific promoter elements and established methods for extraction and purification of that protein (Meade et al., 1999; Rudolph, 1999). Products derived from the mammary gland of transgenic goats and sheep, such as antithrombin III (ATIII), α-antitrypsin or tissue plasminogen activator (tPA) , have progressed to advanced clinical trials (Kues and Niemann, 2004).  would allow the recovery of the product in a conventional way (i.e., by milking), without exerting any adverse effects on the animals. The efficiency with which mammary glands synthesize proteins is enormous. The concentration of endogenous milk proteins is in the order of 4-6%, depending on the species. REPORTER Promotore attivato

44 Che caratteristiche deve avere un animale reporter per permettere lo screening di farmaci?
Permettere di localizzare le aree dove il composto è attivo Permettere di valutare la risposta del farmaco dopo ripetute somministrazioni Permettere la misurazione della minima dose efficace Permettere di identificare siti di accumulo in caso di somministrazioni croniche

45 Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in acuto
Nelle aree del corpo dell’animale Nelle aree del cervello dell’animale

46 Il modello ERE-Luc per lo screening di farmaci – in cronico

47 Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi
Produzione di organi per xenotrapianti 5 Inserimento in animali transgenici della fucosio-transferasi X Rigetto dovuto alla reattività degli anticorpi umani verso le proteine endoteliali esogene (che mancano di uno zucchero, il fucosio)

48 Un maiale ci salverà??