CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO

Presentazione sul tema: "CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO"— Transcript della presentazione:

1 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO
LEZIONE 10 Ingegneria animale I CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO AA Adriana Maggi

2 ANIMALE TRANSGENICO: TRANSGENE
animale nel cui genoma e’ stato introdotto un frammento di DNA esogeno TRANSGENE frammento di DNA esogeno integrato stabilmente nel patrimonio genetico di cellule animali o vegetali

3 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD) Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING) Enucleazione della cellula uovo e inserzione di un nucleo di una cellula somatica (CLONAZIONE)

4 blastocisti in femmina
TRANSGENESI STANDARD GENE TARGETING Microiniezione del DNA clonato Trasfezione del DNA clonato in cellule ES zigote Embrione stadio 2 cellule Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida Impianto nella femmina pseudogravida Topo chimerico 10-20% dei nascituri contiene il transgene Ibrido F1 25-75% della progenie portano il transgene

5 CLONAZIONE Pecore con Pecore con muso giallo muso nero Oocita
enucleato Cellula somatica con nucleo Trasferimento del nucleo nell’oocita Impianto nella pecora Nascita della pecora dal muso giallo

6 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard
SCOPO -GUADAGNO DI FUNZIONE- esprimere un gene esogeno (transgene) in uno o piu’ tessuti dell’animale. (Eccezionalmente si puo’ avere perdita di funzione dovuta alla integrazione del transgene in una sequenza codificante.)

7 Preparazione costrutti Screening della progenie
‘pseudo pregnant’ Preparazione oociti fecondati Transgenesi standard METODO nel dettaglio microiniezione Preparazione costrutti Screening della progenie

8 Preparazione oociti fecondati
Cocktail ormonale Incrocio Recupero uova fecondate

9 Preparazione del costrutto
Purificazione del transgene propagazione del transgene transgene Vettore di clonaggio

10 Impianto degli oociti microiniettati
Preparazione delle ‘pseudo pregnant’ Maschio vasectomizzato Femmina Incrocio Impianto degli oociti microiniettati

11 Microiniezione e reimpianto degli oociti microiniettati
Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida Prelievo delle uova fecondate Microiniezione

12 Screening della progenie
Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per : Southern blot PCR

13 Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo
Southern Blot

14 Tecniche utilizzate per la verifica del genotipo
Polymerase chain reaction Ciclo di base Amplificazione

15 Incroci per l’omozigosi
Founder/wild type F1/F1 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 F2

16 Transgenesi standard - riepilogo procedura -
microiniezione del transgene negli oociti fecondati impianto nella femmina pseudogravida gravidanza e nascita dei ‘Founder’ Screening dei ‘founder’ incroci successivi per ottenere l’animale omozigote

17 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Transgenesi standard
Destino del DNA dopo la microiniezione integrazione stabile nel genoma della linea germinale dell’animale integrazione in singola copia o con maggior frequenza in copie multiple distribuite secondo un tipico arrangiamento ‘in tandem’ integrazione nel genoma in posizione casuale tramite RICOMBINAZIONE NON OMOLOGA

18 SCOPO -PERDITA DI FUNZIONE-
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Gene targeting SCOPO -PERDITA DI FUNZIONE- ablare un gene endogeno attraverso l’inserzione mirata di un transgene

19 GENE TARGETING Trasfezione del DNA clonato in cellule ES
Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Topo chimerico Ibrido F1 25-75% della progenie portano il transgene

20 GENE TARGETING - procedura -
generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES) preparazione del vettore trasfezione delle cellule ES con il vettore iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti generazione di topi mosaico incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale

21 Generazione di cellule staminali ES
Femmine dopo 3-4 giorni dal concepimento Blastocisti Espianto e messa in coltura Crescita in terreno selettivo per le ES Disaggregazione 1 passaggio Linea pura

22 Trasfezione del vettore (elettroporazione)
Trasfezione delle ES Trasfezione del vettore (elettroporazione) Selezione delle cellule knock out Cellule ES

23 Strategia di selezione delle ES knock out
Destino del DNA Integrazione sito specifica Integrazione random Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

24 Ricombinazione omologa
Es. di gene targeting

25 Verifica del genotipo Southern blot PCR

26 Iniezione delle cellule ES nella blastocisti
- generazione di animali mosaico -

27 Incroci per l’omozigosi
Founder/wild type F1/F1 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 F2

28 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Gene targeting
Destino del DNA dopo la microiniezione integrazione stabile nel genoma della linea germinale dell’animale integrazione in singola copia integrazione nel genoma in un sito specifico tramite RICOMBINAZIONE OMOLOGA

29 Clonazione - procedura -
METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Clonazione - procedura - Il nucleo di cellule somatiche (ghiandola mammaria) arrestate nella fase G0 del ciclo cellulare e’ impiantato in un oocita enucleato nella metafase II della meiosi

30 CLONAZIONE Pecore con Pecore con muso giallo muso nero Oocita
enucleato Cellula somatica con nucleo Trasferimento del nucleo nell’oocita Impianto nella pecora Nascita della pecora dal muso giallo

31 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE Clonazione
SCOPI ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di interesse nuovo metodo di transgenesi possibilita’ di ingegnerizzare le cellule somatiche da cui si preleva il nucleo per il reimpianto

32 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Riepilogo transgenesi standard - guadagno di funzione gene targeting - perdita di funzione clonazione - generazione clonale di individui

33 GENERAZIONE DI MUTANTI CONDIZIONALI
Il sistema cre-loxP Gene bersaglio LoxP LoxP CRE RICOMBINASI

34 LID (liver-specific IGF-I gene-deficient)
GENERATION OF THE LID/ERE-Luc MOUSE Luciferase ERE sequences LID (liver-specific IGF-I gene-deficient) ERE-Luciferase Albumin promoter Esone 4 LoxP Cre X Ex 4 80% plasma IGF-I CRE LID/ERE-Luc

35 DELL’INGEGNERIA ANIMALE
APPLICAZIONI FARMACOLOGICHE DELL’INGEGNERIA ANIMALE Studio di funzione genica (ricerca di base) Modelli di patologia umana Produzione di biofarmaci Modelli per lo screening di farmaci

36 Studi di funzione genica
(ricerca di base) Es. Knock-out dei recettori per le lipoproteine a bassa densita’ e implicazione nei meccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi Transgenici per i ligandi dei recettori sopracitati (ApoE e ApoB) e implicazione nei meccanismi patogenetici di insorgenza dell’aterosclerosi

37 Modelli di patologia umana
Utilizzi in farmacologia studio dei meccanismi patogenetici e identificazione di nuovi bersagli farmacologici test dell’attivita’ farmacologica di composti

38 Modelli di patologia umana
Malattie virali Malattie ereditarie Malattie neoplastiche Per approfondimenti Bedell et al. Genes & Development (1997) 11: p

39 Modelli di malattie virali
virus umani spesso non infettano altri mammiferi Si generano modelli transgenici Es. Papovavirus JC responsabile della leucoencefalopatia multifocale sviluppo di una patologia simile nel topo transgenico per il virus

40 Modelli di malattie ereditarie monogeniche
Es. Transgeenico per l’huntightina mutata provoca la malattia di Huntighton nel topo Goldberg, Y. et al., Absence of disease phenotype and intergenerational stability of the CAG repeat in transgenic mice expressing the human Huntington disease transcript. Hum. Molec. Genet. 5: , PubMed ID : Es. Knock out per il cluster genico della beta-globina provoca beta-talassemia nel topo Ciavatta, D. J.; Ryan, T. M.; Farmer, S. C.; Townes, T. M. : Mouse model of human beta-0-thalassemia: targeted deletion of the mouse beta(maj)- and beta(min)-globin genes in embryonic stem cells. Proc. Nat. Acad. Sci. 92: , PubMed ID :

41 Modelli di malattie neoplastiche
Es. Mutazioni nel gene che codifica per APC (ADENOMATOUS POLYPOSIS OF THE COLON) predispongono ai tumori del colon. La mutazione introdotta per gene targeting anche nel topo provocainsorgenza di tumori intestinali.

42 Produzione di biofarmaci
Utilizzo di vettori tessuto specifici per esprimere proteine terapeutiche nel latte o nel siero di animali transgenici

43

44 Modelli per lo screening di farmaci
Topo Transgenico ERE-Luciferasi Modello per lo screening di farmaci attivi sul recettore degli estrogeni.

45 SCREENING OF COMPOUNDS MODULATING ERs ACTIVITY
CMV ER cDNA SERMS trascrizione ER traduzione ER Luciferasi RNA pol ER Attivazione di ER traduzione trascrizione RNA pol Co-Fact. ER NO trascrizione ER ERE prom. LUCIFERASI ERE prom. LUCIFERASI

46 Strategia per la generazione del topo reporter ER-luc

47 INTERESSE FARMACOLOGICO
DEGLI ESTROGENI (Malattie neurodegeneragive) Terapia endocrina dei tumori (Rischi cardiovascolari) Controllo della ferilita’ Disfunzioni endocrine Prevenzione dell’osteoporosi

48 LUCIFERASE EXPRESSION IN LIVER AND BONE
TIME DOSE ANTAGONISTS fold induction 25 250 50 200 E2 C T + E2 T ICI + E2 * fold induction E2 0h 3h 6h 16h 10 20 250 200 300 150 fold induction E2 0.5 5 50 250 (mg/Kg) LIVER 20 10 fold induction E2 0h 3h 6h 16h 30 fold induction E2 0.5 5 50 250 (mg/Kg) 20 10 30 fold induction 20 10 30 E2 C T + E2 T ICI + E2 * BONE

49 0h 24h 3h 6h 6 h IMAGING OF ESTROGENIC ACTIVITY pharmacological
treatment with E2 24h 3h 6h 6 h

50 CYCLING FEMALES PROES. ESTR. DIEST. P E D E D-1 D-2 P
200 400 LIVER 100 E D-1 D-2 P OVARIES 40 80 120 BONE 300 BRAIN PROES. ESTR. DIEST. Estradiol (pg/ml) 25 50 DIEST.-1 DIEST-2 PROEST. ESTRUS 13 P E D