LEZIONE 4 Anno Accademico 2010/11

Presentazione sul tema: "LEZIONE 4 Anno Accademico 2010/11"— Transcript della presentazione:

1 LEZIONE 4 Anno Accademico 2010/11
BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO LEZIONE 4 Anno Accademico 2010/11

2 Le sfide per il futuro del progetto genoma umano
comprendere le componenti strutturali e funzionali del genoma capire come le reti di geni e proteine contribuiscono alla definizione del fenotipo comprendere cosa determina le variazione nella trasmissione dei caratteri genetici identificare le varianti genetiche che contribuiscono al mantenimento dello stato di salute determinare strategie per identificare il rischio di malattia stabilire strategie per l’identificazione del contributo del genoma nella determinazione delle patologie e delle risposte alla terapia utilizzare le conoscenze genetiche per lo sviluppo di farmaci innovativi

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5 I farmaci attualmente sul mercato agiscono su circa 500 prodotti genici
Considerando che il genoma umano contiene circa geni che codificano per proteine, il potenziale per lo sviluppo di nuovi farmaci è evidente

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7 GENOMATICA FUNZIONALE Studio di funzione genica

8 LA RICERCA DELLA FUNZIONE DEI GENI
La tradizione: ricerca di di mutazioni per identificare perdite o acquisizione di funzioni I metodi della genetica all’incontrario: Generare nuovi organismi geneticamente modificati per studiare perdita o acquisizione di funzioni Metodologie innovative: Studio comparativo di popolazioni di prodotti genici

9 La tradizione: ricerca e analisi di mutazioni e polimorfismi (es RFLP; SNP) del genoma stesso

10 Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP)
Siti polimorfici 99.99 % della sequenza del DNA di due individui e’ identica la maggioranza delle differenze (0.01%) coinvolgono singole sostituzioni Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP) Single nucleotide polymorphysm (SNP)

11 Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP)
* Allele 1 Allele 2

12 Polimorfismi al taglio con enzimi di restrizione (RFLP)
associazione RLFP-patologia variab nella popol. Famiglia Patol. sani

13 Probability of birth sequence with a given linkage value
The Lod (log of odds) score is used to calculate the probability of a pedigree arising randomly or by genetic linkage. The test was developed by Newton and Morton                                                                             In practice, linkage is declared if the LOD score is equal to or greater than 3 (i.e. the likelihood of observing the result if the two loci are not linked is less than 1 in 1000). On the other hand, linkage can be completely excluded if the LOD score is strictly below -2. LOD = log Probability of birth sequence with a given linkage value Probability of birth sequence with no linkage

14 Studio di funzione genica
Localizzazione posizionale di geni/malattia Studio di linkage familiare con polimorfismi

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16 Huntington, la malattia ideale per position cloning
Inheritance pattern – dominant autosomal Entirely penetrant and fatal Frequency - about 1/10,000 live births Late onset - age 35 to 45 Because of late onset, many have children before symptoms appear Families with a history of Huntington's disease : Indiana University maintains a National Research Roster for Huntington's Patients Large family with a history of Huntington's disease discovered living on shore of lake Maracaibo in Venezuela For both families with a history of Huntington's disease:  Blood samples taken from each member Permanent cell lines established Each family member analyzed by a neurologist for disease symptoms Paternity verified

17 Gusella's group started with a group of anonymous probes that uncovered RFLPs - very few available. the 12th probe they tried -called G8 - indicated linkage.  Disease associated with the A haplotype in the American family and the C haplotype in the Venezuelan family. LOD Scores  G8 (also called D4S10) mapped approximately 4 cM from the HD locus.  It took 10 more years to clone the gene. DNA markers were used and D4S10 was localized by in situ hybridization and somatic cell genetics to chromosome region 4p16.3;   Further linkage studies for isolating HD Identification of Putative Coding Sequences  Exon Trapping; Use trapped exons to identify candidate genes from cDNAs; Four transcripts were analyzed; IT15 - Huntingtin

18 Gusella JF, Wexler NS, Conneally PM, Naylor SL, Anderson MSA, Tanzi RE, Walkins PC, et al (1983) A polymorphic DNA marker genetically linked to Huntington's disease. Nature 306: Huntingtin DNA, protein and uses thereof US Patent Issued on November 11, 1997 Inventor(s): Marcy E. MacDonald; Christine M. Ambrose; Mabel P. Duyao; James F. Gusella Assignee: The General Hospital Corporation Application: No filed on

19 Metodi di identificazione di SNP

20 Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP)
polimorfismo a singolo nucleotide di base Nel genoma umano ci sono SNP all’interno di sequenze codificanti, alcuni di questi possono essere marcatori di patologia

21 Siti polimorfici per singola sostituzione di base (SNP)
Individuo 1 Individuo 2 Gli SNP sono la causa di circa il 90% della variabilità genetica umana ed in genere si trova uno SNP ogni pb. 2/3 SNP vedono sostituita la C con T. Perchè una variazione possa essere considerata un SNP deve essere presente in almeno l’1% della popolazione

22 IBRIDAZIONE ALLELE-SPECIFICA

23 REAZIONE DI ELONGAZIONE DI PRIMER FISSATO SU SUPPORTO SOLIDO

24 Michiel J. T. van Eijk*, et al. NAR 2004

25 LANDEGREN, et al. Science 1998
AC 3’ TG 5’ GC 3’ TA 5’ AT CG TAGC DNA is denatured and mixed with oligonudeotides and ligase. The ligase joins pairs of oligonudeotides annealed head to tail if they are correctly base-paired at the junction. Radioactively labeled oligonudeotides (*) are immobilized and detected by autoradiography only if ligated to biotinylated oligonucleotides (B) that can be bound to streptavidin on a solid support. LANDEGREN, et al. Science 1998

26 BANCHE DATI E IDENTIFICAZIONE DI SNP
dbSNP sono presenti (“annotati”) in diverse banche dati quali: PubMed, genome project sequences, GenBank records, the Entrez Gene database, and the dbSTS database of sequence tagged sites.

27 Metodologie innovative:
Studio comparativo di popolazioni di prodotti genici genomatica comparativa generazione di arrays per lo studio comparato di espressione genica

28 Genomatica comparativa:
analisi basata sulla omologia di geni codificanti proteine a funzione nota

29 Ortologo e paralogo Ortologhi – geni omologi con la stessa
funzione in organismi diversi Paraloghi – geni all’interno dello stesso organismo derivanti da duplicazione genica

30 Geni ortologhi o paraloghi

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32 ARRAY MACROARRAY MICROARRAY

33 DNA microarray (o gene/genome chip, DNA chip, o gene array) è una collezione di depositi puntiformi di DNA, ciascun punto rapresentante un singolo gene immobilizzati su un supporto (vetro, plastica o silicone) mediante legami di tipo irreversibile. Esempio di microarray con oligo immobilizzati su supporto solido e ibridati con cDNA

34 APPLICAZIONI DI ARRAY:
SNP detection arrays – per identificare polimorfismi di singoli nucleotidi nel genoma di diverse popolazioni ibridazione genomica comparativa (Array CGH) – per identificare riarragiamenti coinvolgenti un numero significtativo di basi mRNA or gene expression profiling – per studiare i livelli di espressione di migliaia di geni simultaneamente Chromatin immunoprecipitation (chIP) studies – per determinare il legame di specifche proteine in porzioni specifiche del DNA (ChIP-on-chip technology)

35 mRNA or gene expression profiling

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38 Drugs x Cells Genes x Cells Clustered Image Maps Genes x Drugs

39 Genomics and bioinformatics group NCI and NIH
Database Microarray Experiment Sets Sample Profiles Genomics and bioinformatics group NCI and NIH

40 Studio di proteine che interagiscono con DNA

41 ChIP-on-chip (o ChIP-chip) è una tecnica che combina la immunoprecipitazione di cromatina (chromatin immunoprecipitation) "ChIP” con la tecnologia del micro array (“chip").

42 Chip-on-chip analysis per lo studio delle interazioni DNA proteine

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44 Normalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati Sito DNA
read-out Normalizzazione dei dati e analisi esplorativa dei dati Sito DNA “estrazione delle informazioni” arricchimento proteina di interesse