Ruolo del calcio nella contrazione muscolare

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1 Ruolo del calcio nella contrazione muscolare
La prima prova del ruolo fisiologico del Ca2+ nella contrazione muscolare fu fornita da S. Ringer e D.W. Buxton nel 1887, i quali osservarono che eliminando il Ca2+ dalla soluzione, il cuore di rana isolato smette di contrarsi. Successivamente L.V Heilbrunn e F.J. Wierczinski nel 1943, dimostrarono che fra vari cationi testati solo l’introduzione di calcio nelle fibre muscolari produceva contrazione muscolare in concentrazioni riferibili a quelle fisiologiche; Una prova decisiva fu ottenuta da A.S. Gyorgyl che nel 1947 mise a punto la tecnica di fibre muscolari estratte, in cui le sostanze solubili sono state allontanate (con glicerolo e bassa temperatura), ed osservò che solo in presenza di Ca2+ si verifica la contrazione indotta da ATP.   In seguito si osservò che la relazione tra le concentrazione di Ca2+ e la tensione sviluppata da miofibrille glicerinate era analoga (sigmoidale) a quella osservabile misurando l’attività ATPasica di omogenati di miofibrille.   Ciò fece supporre che il calcio fosse un cofattore dell’attività ATPasica della miosina.     Tale ipotesi si rivelò errata, poiché: 1) purificando gli estratti actomiosinici dalle proteine troponina e tropomiosina associate all’actina, la dipendenza dal Ca2+ per l’attività ATPasica e contrattile spariva; 2) usando agenti chelanti del Ca2+ (EGTA, EDTA) si dimostrò che solo il Mg2+ fosse cofattore necessario all’attività ATPasica.

2 Ruolo della tropomiosina e del complesso troponina
Secondo il modello proposto da S. Ebashi nel 1980 in condizioni di bassa [Ca 2+]in il complesso di troponina (Tn) formato da unità C, T (1, 2) e I, si lega con actina e tropomiosina costringendo quest’ultima a inibire stericamente l’attacco dei ponti trasversi della miosina ai siti dell’actina. [Ca2+] sarcoplasmatica >10 –7 M consente legame di Ca2+ a TnC, causa cambio conformazionale sub-unità complesso troponina, con conseguente allontanamento della tropomiosina dal sito legante la miosina. L’attività dei ponti trasversi può procedere finchè non viene rimosso il Ca2+ dalla TnC.

3 Il sistema tubulare sarcoplasmatico
Nel 1958 A.F. Huxley e R.E. Taylor stimolando la superficie delle singole fibre muscolari di rana con microelettrodi capillari di vetro osservarono che: 1)      contrazioni locali si manifestavano solo se la punta del capillare è situata in corrispondenza della linea Z; 2)      all’aumentare della corrente stimolante, la contrazione di propaga verso l’interno, ma non in senso longitudinale.

4 Il sistema tubulare sarcoplasmatico
Le fotografie al microscopio elettronico hanno fornito i correlati anatomici a queste scoperte: 1)   intorno al perimetro di ogni miofibrilla decorre un tubulo trasverso (tubulo T) con diametro inferiore a 0,1 m, che si ramifica in modo da risultare continuo con i tubuli che circondano miofibrille vicine; 2)  il sistema di Tubuli T arriva fino alla membrana superficiale, cui è collegato; 3)   è in comunicazione con lo spazio extracellulare come confermato dal fatto che la ferritina e la perossidasi di rafano (molecole proteiche opache agli elettroni) aggiunte al mezzo di incubazione, penetrano nei tubuli T. 4) Interrompendo le connessioni tra tubuli T e membrana superficiale mediante shock osmotico (glicerolo 50% in soluzione), la depolarizzazione della membrana superficiale non era più in grado di stimolare la contrazione muscolare

5 Accoppiamento depolarizzazione tubuli T e rilascio Ca2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico
1) Depolarizzazione della membrana tubulo T conseguente al potenziale d’azione sul sarcolemma; 2) modificazione conformazionale di una proteina sensibile al voltaggio sulla membrana del tubulo T ; 3) mediante accoppiamento meccanico diretto, apertura di grossi canali rilascianti Ca 2+ , situati nella membrana del RS da cui si estendono come pilastri sino alle proteine di membrana voltaggio dipendenti dei tubuli T; 4) fuoriuscita del Ca2+ nella fessura di giunzione tubulo T e RS provoca apertura di altri canali del Ca2+ ; 5)      flusso di Ca2+ nel citosol della fibra muscolare; 6)      contrazione contemporanea miofibrille (trasmissione segnale impiega pochi millisecondi) ricaptazione Ca2+ mediante ATPasi del Ca2+ ) 1)      depolarizzazione della membrana tubulo T conseguente al potenziale d’azione sul sarcolemma; 2)      modificazione conformazionale di una proteina sensibile al voltaggio sulla membrana del tubulo T ; 3)      mediante accoppiamento meccanico diretto, apertura di grossi canali rilascianti Ca2+, situati nella membrana del RS da cui si estendono come pilastri sino alle proteine di membrana voltaggio dipendenti dei tubuli T; 4)      fuoriuscita del Ca2+ nella fessura di giunzione tubulo T e RS provoca apertura di altri canali del Ca2+; 5)      flusso di Ca2+ nel citosol della fibra muscolare; 6)      contrazione contemporanea miofibrille (trasmissione segnale impiega pochi millisecondi) ricaptazione Ca2+ mediante ATPasi del Ca2+)

6 Inattivazione dei ponti trasversi e rilasciamento muscolare
La rimozione di Ca 2+ dal sarcoplasma, operata dal reticolo sarcoplasmatico, mantiene [Ca2+] < M, 1) inattivazione ponti trasversi e rilasciamento muscolare; 2)  il rilasciamento non è prodotto dalla rimozione di ATP; il rilasciamento, come la contrazione si verifica solo se è presente Mg2+-ATP

7 Accoppiamento elettromeccanico Potenziale di membrana e contrazione
Il potenziale d’azione della fibra nervosa motoria provoca: 1)     rilascio di acetilcolina; 2)     potenziale post-sinaptico; 3)     potenziale d’azione che dalla placca motrice si propaga nelle due direzioni eccitando tutta la membrana della fibra muscolare; 4)     periodo di latenza e contrazione muscolare del tipo tutto o nulla

8 1) diametro fibra muscolare elevato (50-100 m);
Esponendo singole fibre muscolari di rana a varie [K+]est e registrando simultaneamente potenziale di membrana e tensione muscolare si osserva che aumentando depolarizzazione la tensione aumenta con andamento sigmoidale (Hogkin e Horowicz, 1960); -  ciò dimostra che il sistema contrattile è capace di una risposta graduata a gradi diversi di depolarizzazione; Nè tali variazioni di potenziale elettrico di membrana, né la possibile entrata di Ca2+ in cellula potevano attivare direttamente la > parte delle miofibrille perché: 1)     diametro fibra muscolare elevato ( m); 2)     correnti di intensità fisiologica tra due elettrodi inseriti in una fibra muscolare non producevano alcuna contrazione; tasso di diffusione di uno ione, dalla membrana plasmatica al centro della fibra (25-50 m di raggio), troppo lento per spiegare la breve latenza (2 ms) tra potenziale d’azione e attivazione totale della fibra muscolare (Hill 1948). - quindi la scossa muscolare è di tipo tutto-o-nulla perché è di questo tipo il potenziale d’azione che, supera notevolmente il plateau al quale risulta saturata l’attivazione meccanica durante la depolarizzazione stazionaria. -  Esponendo singole fibre muscolari di rana a varie [K+]est e registrando simultaneamente potenziale di membrana e tensione muscolare si osserva che aumentando depolarizzazione la tensione aumenta con andamento sigmoidale (Hogkin e Horowicz, 1960); -  ciò dimostra che il sistema contrattile è capace di una risposta graduata a gradi diversi di depolarizzazione; Nè tali variazioni di potenziale elettrico di membrana, né la possibile entrata di Ca2+ in cellula potevano attivare direttamente la > parte delle miofibrille perché: 1)     diametro fibra muscolare elevato ( m); 2)     correnti di intensità fisiologica tra due elettrodi inseriti in una fibra muscolare non producevano alcuna contrazione; tasso di diffusione di uno ione, dalla membrana plasmatica al centro della fibra (25-50 m di raggio), troppo lento per spiegare la breve latenza (2 ms) tra potenziale d’azione e attivazione totale della fibra muscolare (Hill 1948). -  quindi la scossa muscolare è di tipo tutto-o-nulla perché è di questo tipo il potenziale d’azione che, supera notevolmente il plateau al quale risulta saturata l’attivazione meccanica durante la depolarizzazione stazionaria.

9 Il reticolo sarcoplasmatico
Il reticolo sarcoplasmatico (RS) che avvolge ogni miofibrilla da una linea Z all’altra, costituisce un compartimento delimitato da una membrana distinto dal sarcoplasma; le cisterne terminali dei reticoli sarcoplasmatici di due sarcomeri contigui entrano in intimo contatto con il tubulo T interposto tra essi. Quando vengono isolate, le membrane del reticolo sarcoplasmatico formano vescicole microscopiche (diametro 1 m) che possono captare Ca2+ dal mezzo circostante ed in presenza di ossalato si formano precipitati di ossalato di calcio; L’attività di sequestro di Ca 2+ operata dal reticolo sarcoplasmatico è abbastanza elevata da mantenere concentrazioni di Ca 2+ libero nel sarcoplasma del muscolo al di sotto di 10 -7M ; L’attività di sequestro del Ca 2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico è esercitata da una ATPasi – Ca 2+ presente sulla sua membrana, che corrisponde al 90% delle proteine di membrana dell’organello. E’ facilitata inoltre dalla calsequestrina, proteina legante Ca 2+ presente nell’interno del RS che riduce il gradiente di concentrazione di Ca 2+ contro cui deve lavorare la pompa

10 Regolazione del calcio da parte reticolo sarcoplasmatico.
Stabilito che gli ioni Ca2+ sono accumulati dal reticolo sarcoplasmatico, appariva verosimile che la contrazione muscolare avvenisse in conseguenza del rilascio nel sarcoplasma del Ca2+ contenuto all’interno delle vescicole. La prova diretta che la concentrazione di Ca2+ aumenta in risposta alla stimolazione è stata ottenuta con metodo fotometrico che utilizza la proteina Ca2+ sensibile, equorina. Una molecola di equorina combinandosi con tre ioni Ca2+ emette un fotone di luce visibile; l’equorina è stata iniettata in fibre muscolari di crostacei che non hanno potenziali d’azione e la depolarizzazione della membrana può essere graduata; con un fotomoltiplicatore si registrano le variazioni di luce emessa quando il Ca2+ viene rilasciato dal RS; Una sufficiente depolarizzazione induce l’emissione di luce (> Ca2+) insieme ad una > tensione. La contrazione muscolare può essere indotta da caffeina o teofillina che stimolano rilascio di Ca2+ da parte del reticolo sarcoplasmatico. La liberazione di Ca2+ da RS dipende dal livello del potenziale elettrico di membrana e si verifica a –50 mV ; la massima liberazione di Ca2+ si verifica a –20 mV.

11 Ruolo del Ca2+ nel muscolo cardiaco
Studi con cuori isolati e perfusi con soluzioni saline isotoniche hanno dimostrato che rimozione di Ca 2+ extracellulare diminuisce forza contrattile, aumento di Ca 2+ incrementa forza contrattile. Meccanismo di accoppiamento eccitazione contrazione A) contrazione 1)      onda di eccitazione si propaga lungo il sarcolemma, trasferendosi di cellula in cellula mediante gap-junction; 2)      eccitazione si diffonde all’interno della cellula mediante tubuli T; 3)      stimolazione elettrica o applicazione di Ca 2+ ionizzato ad una stria z determina contrazione locale delle miofribrille vicine; 4)      durante plateau, Ca2+ entra tramite canali voltaggio dipendenti, attivati da fosforilazione mediata da protein-chinasi AMPc-dipendente; 5)      entrata di Ca 2+ innesca (Ca 2+ trigger) rilascio di Ca 2+ dal reticolo sarcoplasmatico; 6)      Ca 2+ aumenta nel citosol da a M, legandosi alla troponina C; 7)      Complesso Ca2+-troponina interagisce con tropomiosina, sblocca i siti attivi fra filamenti di actina e miosina; Ruolo del Ca2+ nel muscolo cardiaco 8) interazione ponti trasversi che iniziano i loro cicli determinando contrazione miofibrille (sistole); A) decontrazione 1) Il reticolo sarcoplasmatico ricapta Ca 2+ mediante pompa del calcio stimolata dal fosfolambano dopo che questa sostanza è stata fosforilata da una protein-chinasi AMPc-dipendente; 2)      fosforilazione della troponina I inibisce fissazione Ca 2+ alla troponina C; 3)      inibizione della tropomiosina sui siti di interazione actina-miosina; 4)      rilasciamento muscolo cardiaco; 5)      il Ca 2+ entrato in cellula per iniziare la contrazione è rimosso durante la diastole dallo scambio elettrogenico di 3 Na+/ 1 Ca 2+ del sarcolemma (o ad opera di una ATPasi del Ca 2+ ) B) Regolazione 1)      catecolammine mediante AMPc accellerano sia la contrazione che la decontrazione del miocardio; 2)      glicosidi cardiaci, inibendo Na+/K+-ATPasi, diminuiscono gradiente elettrochimico del Na+ e quindi, indirettamente 3Na+/1Ca2+; Ca2+ intracellulare rimane elevata ed aumenta forza di contrazione

12 Ruolo del Ca2+ nel muscolo liscio
-  E’ stato dimostrato che la miosina chinasi e la miosina fosfatasi fosforilano (a livello di un residuo di serina) e defosforilano rispettivamente uno specifico sito posto lungo le catene leggere regolatrici della miosina facenti parte del ponte trasverso; -  la fosforilazione è Ca2+-dipendente poiché forma attiva della miosina chinasi è un complesso con la calmodulina citoplasmatica legante 4 ioni Ca2+ (legame cooperativo) -  la fosforilazione è necessaria e sufficiente ad attivare l’idrolisi di ATP da parte di actina e miosina isolate da muscolo liscio; -  la rimozione del Ca2+ inattiva la miosin-chinasi con defosforilazione della miosina da parte della miosina-fosfatasi;

13 Fosforilazione ponti trasversali e contrazione
- La fosforilazione è proporzionale alla concentrazione di Ca2+ nella contrazione fasica; - se i muscoli sono tonicamente stimolati, invece di incrementare ad un valore proporzionale alla stimolazione, la concentrazione di Ca2+ e la fosforilazione dei ponti trasversi, dopo un picco iniziale tendono a decadere a valori più bassi; - nonostante ciò la forza di contrazione aumenta e si mantiene elevata per tutto il periodo di stimolazione; - ciò conferisce al muscolo liscio un notevole vantaggio fisiologico; - ciò vuol dire anche che allo sviluppo della forza devono contribuire i ponti trasversali defosforilati - La fosforilazione è proporzionale alla concentrazione di Ca2+ nella contrazione fasica; - se i muscoli sono tonicamente stimolati, invece di incrementare ad un valore proporzionale alla stimolazione, la concentrazione di Ca2+ e la fosforilazione dei ponti trasversi, dopo un picco iniziale tendono a decadere a valori più bassi; - nonostante ciò la forza di contrazione aumenta e si mantiene elevata per tutto il periodo di stimolazione; - ciò conferisce al muscolo liscio un notevole vantaggio fisiologico; - ciò vuol dire anche che allo sviluppo della forza devono contribuire i ponti trasversali defosforilati

14 Regolazione covalente dei ponti trasversali
  Secondo l’ipotesi correntemente accettata nei muscoli lisci contratti i ponti trasversali hanno 4 stati: liberi, attaccati, fosforilati e defosforilati; -  La miosin-chinasi e la miosina fosfatasi possono agire sui ponti trasversali sia liberi che attaccati; -  I ponti trasversali fosforilati hanno un ciclo relativamente veloce (più lento rispetto al muscolo striato); -      Un ciclo lento (fosforilazione, attacco, defosforilazione, distacco) che utilizza 2 molecole di ATP; -      Se la Ca2+ è si innalza, l’attività della miosin-chinasi sarà elevata e gran parte dei ponti trasversi saranno fosforilati, producendo un rapido aumento della forza di contrazione; -      Quando Ca2+ scende a livelli moderati, la fosforilazione si riduce, ma la forza viene mantenuta dalla persistenza dei ponti trasversali allo stato 4, poiché la loro velocità di distacco è bassa; Queste caratteristiche consentono al muscolo liscio di eseguire contrazioni fasiche veloci e sostenere carichi imposti durante contrazioni toniche prolungate

15 Regolazione della concentrazione mioplasmatica del calcio
Il sarcolemma regola gli scambi di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - le membrane del reticolo sarcoplasmatico regolano invece il movimento di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - il fatto che esistano numerosi meccanismi per regolare il Ca2+ mioplasmatico è fisiologicamente importante poiché: 1)      i muscoli lisci devono produrre vari tipi di attività meccanica; 2) l’attività delle diverse cellule deve essere coordinata tra loro; Ruolo del reticolo sarcoplasmatico L’attivazione di RS, non dipendente da variazioni di potenziale di membrana, ma dal legame di IP3 con i suoi recettori, apre i canali del Ca2+ determinando il rapido incremento della sua concentrazione plasmatica (risposta fasica); - Il sarcolemma regola gli scambi di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - le membrane del reticolo sarcoplasmatico regolano invece il movimento di Ca2+ tra il mioplasma ed il pool extracellulare; - il fatto che esistano numerosi meccanismi per regolare il Ca2+ mioplasmatico è fisiologicamente importante poiché: 1)      i muscoli lisci devono produrre vari tipi di attività meccanica; 2) l’attività delle diverse cellule deve essere coordinata tra loro; Ruolo del reticolo sarcoplasmatico L’attivazione di RS, non dipendente da variazioni di potenziale di membrana, ma dal legame di IP3 con i suoi recettori, apre i canali del Ca2+ determinando il rapido incremento della sua concentrazione plasmatica (risposta fasica); Ruolo del sarcolemma Riduzione concentrazione mioplasmatica di Ca2+ avviene mediante lo scambio 3 Na+/ 1 Ca2+ e l’ATPasi del Ca2+; la contrazione tonica dipende dall’entrata del Ca2+ dal pool extracellulare, attraverso il sarcolemma, mediante due tipi di canali: 1)          attivati da recettori per neurotrasmettitori o ormoni inibitori cui sono collegati mediante proteine G (accoppiamento farmaco-meccanico); 2)          voltaggio-dipendenti la cui conduttanza aumenta con la depolarizzazione; pertanto potenziali d’azione, depolarizzazioni graduate (< attività della Na+/K+-ATPasi; depolarizzazioni trasmesse da altre cellule mediante gap-junction. Ruolo del sarcolemma Riduzione concentrazione mioplasmatica di Ca2+ avviene mediante lo scambio 3 Na+/ 1 Ca2+ e l’ATPasi del Ca2+; la contrazione tonica dipende dall’entrata del Ca2+ dal pool extracellulare, attraverso il sarcolemma, mediante due tipi di canali: 1) attivati da recettori per neurotrasmettitori o ormoni inibitori cui sono collegati mediante proteine G (accoppiamento farmaco-meccanico); 2) voltaggio-dipendenti la cui conduttanza aumenta con la depolarizzazione; pertanto potenziali d’azione, depolarizzazioni graduate (< attività della Na+/K+-ATPasi; depolarizzazioni trasmesse da altre cellule mediante gap-junction.