Centrifugazione Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (Campo centrifugo). Viene.

Presentazione sul tema: "Centrifugazione Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (Campo centrifugo). Viene."— Transcript della presentazione:

1 Centrifugazione Alle sospensioni viene applicato un campo gravitazionale artificiale attraverso la rotazione ad alta velocità (Campo centrifugo). Viene sfruttata la differenza di densità tra le particelle ed il mezzo in cui sono sospese

2 Il principio della centrifugazione
Campo gravitazionale indotto con la centrifugazione Sopranatante Precipitato (pellet) Sospensione Separazione completata

3 Campo centrifugo Il campo centrifugo (G) è dato da:
Dove  è la velocità di rotazione espressa in radianti·s-1 r è la distanza dall’asse di rotazione. Per esprimere la velocità di rotazione in giri·min-1 (RPM): Il campo centrifugo viene quindi definito come:

4 Campo centrifugo relativo
In genere il campo centrifugo viene espresso come campo centrifugo relativo (RCF) come multiplo della costante gravitazionale (980 cm·s-2): Che diventa:

5 Velocità di sedimentazione
Per F = F0 il moto è rettilineo uniforme

6 Velocità di sedimentazione
della particella Raggio della particella Densità della particella Densità del mezzo Campo gravitazionale Costante per una sfera Viscosità del mezzo

7 Velocità di sedimentazione
Se una particella ha una densità uguale a quella del mezzo: non vi è sedimentazione.

8 Tempo di sedimentazione
Il tempo di sedimentazione si ottiene attraverso l’integrazione della legge di Stokes tra due raggi: rt = raggio di rotazione alla superficie e rb = raggio di rotazione al fondo rt rb

9 Coefficiente di sedimentazione

10 Coefficiente di sedimentazione
1 S (Svedberg) = 10-13

11 Centrifughe Centrifuga da banco Ultracentrifuga

12 Centrifughe Da banco 4000-6000 3000-7000 Micro max. 16000 max. 22000
RPM g Da banco Micro max max Super ~ ~ 60000 Ultra ~ ~

13 Centrifugazione differenziale
Solvente Particelle piccole Campo centrifugo Particelle medie Particelle grandi Tempo di centrifugazione All’inizio le particelle sono distribuite uniformemente nel mezzo (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni e della loro densità.

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15 Centrifugazione in gradiente di densità:
Zonale Isopicnica (uguale densità)

16 Centrifugazione zonale
Campione Particelle piccole Campo centrifugo Particelle medie Gradiente di densità Particelle grandi All’inizio le particelle sono stratificate al di sopra del gradiente (A), alla fine (Z) sono sedimentate in funzione delle loro dimensioni, della loro densità e della densità del mezzo.

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18 Centrifugazione zonale (con centrifuga apposita)
Il gradiente è caricato nel rotore. il rotore è accelerato lentamente, il gradiente si riorienta Il campione è pompato ad una estremità del rotare Il campione sedimenta radialmente Alla fine il rotore decelera lentamente, Il gradiente si riorienta senza disturbare le bande di particelle Le bande vengono estratte usando una pompa peristaltica.

19 Centrifugazione isopicnica
Particelle piccole Campo centrifugo Particelle medie che si vogliono separare Particelle grandi All’inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A) che ha densità uguale a quella delle particelle che si vogliono separare, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del mezzo uguale alla loro.

20 Centrifugazione isopicnica con gradiente
Particelle piccole Campo centrifugo Particelle medie Particelle grandi All’inizio le particelle sono disperse nel mezzo (A), durante la centrifugazione si forma il gradiente, alla fine (Z) le particelle galleggiano alla densità del gradiente uguale alla loro.

21 Rotori Rotore ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso hanno piccole differenze tra rmax e rmin Il tempo richiesto per la sedimentazione è minore per rotori ad angolo fisso I rotori ad angolo fisso sono più pesanti e necessitano di una maggiore energia per operare I rotori a bracci mobili (Swing out) sono da preferire per centrifugare cellule e particelle Per sedimentare macromolecole e particelle fini si usano rotori ad angolo fisso I rotori a brazzi mobili sono da preferire per la centrifugazione su gradiente. rmax - rmin Rotore swing-out rmax - rmin

22 Gradiente su rotore swing-out

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24 Rotori Rotore swing-out Rotore ad angolo Fisso Rotore zonale

25 Attenzione ai rotori !!!

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