Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico 2006-2007 Lolio doliva Lolio doliva è un alimento estremamente importante della.

Presentazione sul tema: "Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico 2006-2007 Lolio doliva Lolio doliva è un alimento estremamente importante della."— Transcript della presentazione:

1 Università del Piemonte Orientale – Facoltà di Scienze – anno accademico 2006-2007 Lolio doliva Lolio doliva è un alimento estremamente importante della nostra dieta, in quanto apporta un elevato contributo di sostanze nutritive, in particolare acidi grassi polinsaturi, vitamine e sostanze antiossidanti. Esso è inoltre un prodotto dalle implicazioni economiche notevoli, a causa delle numerose varianti nelle quali è commercializzato. Queste sono stabilite dal regolamento CEE 1513/2001 secondo le seguenti definizioni: Oli doliva vergini ottenuti dal frutto dell'olivo soltanto mediante processi meccanici o altri processi fisici, in condizioni che non causano alterazioni dell'olio, e che non hanno subito alcun trattamento diverso dal lavaggio, dalla decantazione, dalla centrifugazione e dalla filtrazione, esclusi gli oli ottenuti mediante solvente o con coadiuvanti ad azione chimica o biochimica o con processi di riesterificazione e qualsiasi miscela con oli di altra natura. Essi sono soggetto della classificazione e delle denominazioni seguenti: Oli doliva vergini ottenuti dal frutto dell'olivo soltanto mediante processi meccanici o altri processi fisici, in condizioni che non causano alterazioni dell'olio, e che non hanno subito alcun trattamento diverso dal lavaggio, dalla decantazione, dalla centrifugazione e dalla filtrazione, esclusi gli oli ottenuti mediante solvente o con coadiuvanti ad azione chimica o biochimica o con processi di riesterificazione e qualsiasi miscela con oli di altra natura. Essi sono soggetto della classificazione e delle denominazioni seguenti: Olio extra vergine di oliva, con acidità libera massima 0.8 % Olio extra vergine di oliva, con acidità libera massima 0.8 % Olio di oliva vergine, con acidità libera massima 2.0 % Olio di oliva vergine, con acidità libera massima 2.0 % Olio di oliva lampante, con acidità libera superiore al 2.0 % Olio di oliva lampante, con acidità libera superiore al 2.0 % Olio doliva raffinato ottenuto dalla raffinazione dell'olio di oliva vergine, con acidità libera non superiore a 0.3 % Olio doliva raffinato ottenuto dalla raffinazione dell'olio di oliva vergine, con acidità libera non superiore a 0.3 % Olio doliva – composto di oli di oliva raffinati e vergini, ottenuto dal taglio di olio di oliva raffinato con olio di oliva vergine (non lampante) e acidità libera massima di 1 % Olio doliva – composto di oli di oliva raffinati e vergini, ottenuto dal taglio di olio di oliva raffinato con olio di oliva vergine (non lampante) e acidità libera massima di 1 % Olio di sansa di oliva greggio ottenuto dalla sansa d'oliva mediante trattamento con solventi o mediante processi fisici, oppure olio corrispondente all'olio di oliva lampante Olio di sansa di oliva greggio ottenuto dalla sansa d'oliva mediante trattamento con solventi o mediante processi fisici, oppure olio corrispondente all'olio di oliva lampante Olio di sansa di oliva raffinato ottenuto dalla raffinazione dell'olio di sansa di oliva greggio, con acidità libera non superiore a 0.3 % Olio di sansa di oliva raffinato ottenuto dalla raffinazione dell'olio di sansa di oliva greggio, con acidità libera non superiore a 0.3 % Olio di sansa di oliva ottenuto dal taglio di olio di sansa di oliva raffinato e di olio di oliva vergine diverso dall'olio lampante, con acidità libera non superiore a 1 % Olio di sansa di oliva ottenuto dal taglio di olio di sansa di oliva raffinato e di olio di oliva vergine diverso dall'olio lampante, con acidità libera non superiore a 1 %

2 Cosa dice letichetta Lesame delletichetta e della documentazione che accompagna una bottiglia di olio fornisce indicazioni sulla serietà del produttore e sulla presumibile qualità del prodotto. La legge, a questo proposito, non è particolarmente prescrittiva, e lascia alla buona volontà dei produttori lindicazione di gran parte dei dati che servirebbero ad identificare con una certa precisione le caratteristiche del prodotto acquistato, fermo restando che i parametri analitici necessari per la commercializzazione (es. acidità) sono da intendersi soddisfatti

3 Le informazioni più importanti Fondamentale criterio per valutare laffidabilità di un olio è la trasparenza in termini di informazione: tanto più un olio è corredato da dati analitici di accompagnamento, in cui vengano evidenziati i parametri stabiliti dalla legge, tanto maggiori sono le probabilità che il produttore sia seriamente interessato ad accrescere la consapevolezza del consumatore rispetto alla qualità del proprio lavoro. Altra regola importante è il preferire bottiglie dal vetro scuro o fasciate; lidentità del produttore; lidentità del produttore; la quantità contenuta nella bottiglia; la quantità contenuta nella bottiglia; la data di confezionamento; la data di confezionamento; la categoria merceologica dellolio la categoria merceologica dellolio un soggiorno prolungato in condizioni di eccessiva esposizione alla luce può avere effetti nocivi anche su un prodotto inappuntabile allorigine Tra le informazioni veramente essenziali devono essere citati con chiarezza:

4 Categorie merceologiche Le categorie merceologiche di maggior pregio sono quelle DOP (Denominazione di Origine Protetta) o IGP (Indicazione Geografica Protetta), per prodotti che hanno ottenuto il riconoscimento di tipicità in forza del reg. CEE n. 2081/92: si tratta di oli di oliva per i quali cè lindicazione di una regione, un luogo determinato o, in casi eccezionali, di un paese che serve a designare il prodotto originario delle suddette aree, la cui qualità è dovuta essenzialmente allambiente geografico, ai fattori naturali ed umani e la cui produzione, trasformazione ed elaborazione avvengano nellarea geografica delimitata o, per la IGP, la cui produzione e/o trasformazione e/o elaborazione avvengano nellarea determinata

5 Diciture non commerciali Alcune diciture non ufficiali riportate sulle etichette delle bottiglie sono: Meno utili risultano invece le analisi del valore nutrizionale del prodotto, dal momento che i dati riportati, es. il contenuto lipidico, risultano gli stessi per tutti gli oli Prima spremitura - si tratta di un olio vergine, però è sempre possibile che una prima spremitura dia un olio cui mancano i titoli per rientrare nella categoria degli extravergini; Prima spremitura - si tratta di un olio vergine, però è sempre possibile che una prima spremitura dia un olio cui mancano i titoli per rientrare nella categoria degli extravergini; Olio dietetico - si tratta di oli addizionati di vitamine e altri componenti essenziali e non, come si sarebbe portati a credere, di oli che non fanno ingrassare; Olio dietetico - si tratta di oli addizionati di vitamine e altri componenti essenziali e non, come si sarebbe portati a credere, di oli che non fanno ingrassare; Light - ossia leggero, denominazione oggi molto di moda per prodotti di colorazione non troppo intensa e che allapparenza diano una sensazione di bassa densità; lapporto calorico è identico per tutti gli oli, indipendentemente dalla colorazione! Light - ossia leggero, denominazione oggi molto di moda per prodotti di colorazione non troppo intensa e che allapparenza diano una sensazione di bassa densità; lapporto calorico è identico per tutti gli oli, indipendentemente dalla colorazione! Spremuto a freddo - durante tutte le fasi del processo produttivo, il mantenimento di temperature più basse possibili dovrebbe essere garantito, fermo restando che una lavorazione assolutamente a freddo è impossibile; Spremuto a freddo - durante tutte le fasi del processo produttivo, il mantenimento di temperature più basse possibili dovrebbe essere garantito, fermo restando che una lavorazione assolutamente a freddo è impossibile; Mosto - è una emulsione di olio con acqua nebulizzata e mucillagini in sospensione Mosto - è una emulsione di olio con acqua nebulizzata e mucillagini in sospensione

6 Composizione dellolio di oliva Dal punto di vista chimico, lolio di oliva è suddivisibile in due frazioni, a seconda del comportamento a caldo in presenza di una base forte (NaOH o KOH): Saponificabile, formata da sostanze in grado di formare saponi nelle condizioni citate; questa frazione corrisponde al 98-99% del totale e comprende trigliceridi, digliceridi e monogliceridi, i cui acidi sono per l85% insaturi (acido oleico e linoleico) e per il 15% saturi (acido palmitico, stearico) Saponificabile, formata da sostanze in grado di formare saponi nelle condizioni citate; questa frazione corrisponde al 98-99% del totale e comprende trigliceridi, digliceridi e monogliceridi, i cui acidi sono per l85% insaturi (acido oleico e linoleico) e per il 15% saturi (acido palmitico, stearico) Insaponificabile, formata da microcomponenti che non formano saponi nelle condizioni citate; anche se è presente in quantità modeste (1-2% circa) questa frazione è importantissima da un punto di vista nutrizionale e analitico, per controllare la genuinità dell'olio e per la sua serbevolezza Insaponificabile, formata da microcomponenti che non formano saponi nelle condizioni citate; anche se è presente in quantità modeste (1-2% circa) questa frazione è importantissima da un punto di vista nutrizionale e analitico, per controllare la genuinità dell'olio e per la sua serbevolezza

7 Frazione insaponificabile I componenti principali sono: Idrocarburi (30 - 40%) tra cui lo squalene Idrocarburi (30 - 40%) tra cui lo squalene Cere, presenti in minima quantità Cere, presenti in minima quantità Steroli, presenti in notevoli quantità Steroli, presenti in notevoli quantità Alcoli, in piccolissime quantità alcoli alifatici e in quantità maggiori alcoli triterpenici Alcoli, in piccolissime quantità alcoli alifatici e in quantità maggiori alcoli triterpenici Pigmenti colorati, come carotenoidi e clorofilla Pigmenti colorati, come carotenoidi e clorofilla Vitamine liposolubili, provitamina A, vitamina C, D, E ed F Vitamine liposolubili, provitamina A, vitamina C, D, E ed F Polifenoli, sotto forma di glucosidi e di esteri Polifenoli, sotto forma di glucosidi e di esteri Altri composti più o meno volatili: alcoli, aldeidi, esteri, chetoni alifatici e aromatici Altri composti più o meno volatili: alcoli, aldeidi, esteri, chetoni alifatici e aromatici

8 La qualità dellolio doliva Gli aspetti principali che caratterizzano la qualità dellolio di oliva sono i caratteri organolettici, la stabilità allossidazione, lassenza di contaminanti (fitofarmaci, solventi) e, naturalmente, le caratteristiche nutrizionali espresse in termini di acidi grassi saturi, monoinsaturi e polinsaturi, presenza di fitosteroli, vitamine ed antiossidanti naturali Come per ogni prodotto di trasformazione agroalimentare, il pregio dellolio consiste, quindi, nel mantenimento e nellesaltazione delle caratteristiche proprie della materia prima di origine, ossia delle olive. È impossibile produrre un olio buono partendo da una materia prima scadente, nemmeno utilizzando i più sofisticati procedimenti di estrazione

9 Valutazione della qualità È da notare che a tuttoggi non esiste uno strumento che, basandosi su parametri chimico-fisici, sia in grado di valutare ogni singolo componente che partecipi a formare le infinite tonalità aromatiche di un extravergine; per questo motivo è fondamentale affidarsi allanalisi sensoriale. Le caratteristiche organolettiche ci permettono, infatti, di distinguere prodotti che le determinazioni analitiche possono identificare come identici La qualità riconosciuta agli oli extravergini è infatti la risultante di due diversi ordini di indagine: da una parte, le analisi chimico- fisiche, per accertare la reale composizione in termini di materia grassa e grado di acidità; dallaltra, lesame organolettico, che giudica lolio dal punto di vista delle sue caratteristiche visive, olfattive e di gusto

10 Valutazione organolettica Lolio doliva è il primo prodotto alimentare per cui lanalisi sensoriale, basata sul sistema del Panel Test (particolare metodologia analitica standardizzata che vede operare un gruppo di assaggiatori selezionati, istruiti ed allenati), costituisce una discriminante merceologica NellAllegato XII Valutazione organolettica dellolio di oliva vergine del regolamento CEE n. 2568/91 si stabilisce che un olio debba essere sottoposto allassaggio al fine di determinarne, mediante punteggio, la categoria merceologica di appartenenza

11 Analisi sensoriale L'analisi sensoriale o organolettica sull'olio d'oliva ha un'importanza rilevante nel giudizio della qualità finale del prodotto per verificare se un olio che ha qualità chimiche opportune per essere considerato extravergine le ha anche da un punto di vista organolettico, dato che un olio che non sia organoletticamente accettabile è declassato come specificato nella tabella Le analisi sono svolte presso i laboratori della Camera di commercio e di altri Enti, oppure, se il produttore d'olio commercia ingenti quantità, in commissioni interne all'azienda stessa. Le commissioni sono formate da un capo panel e da un minimo di otto ad un massimo di dodici assaggiatori per minimizzare l'errore, l'assaggio è svolto in cabine separate per non far influenzare tra loro gli assaggiatori. Al termine dell'assaggio il capo panel si occuperà di effettuare una media tra i voti dati dai vari assaggiatori scartando quelli che siano eccessivamente incongruenti con gli altri

12 Panel test Panel test è un termine inglese che significa gruppo di persone che si riuniscono per esprimere un giudizio. L'indagine statistica sulle soglie personali di percezione ha permesso di accertare che gruppi di 10 persone, scelte a caso in una popolazione, presentano una soglia media di gruppo che è ripetitiva, cioè analoga a quella di un altro gruppo di altre 10 persone della stessa popolazione; ossia gruppi di 10 individui, presentano una soglia media di gruppo che può essere ritenuta rappresentativa della soglia dell'intera popolazione e, pertanto, tale gruppo può essere utilizzato come uno strumento di misura che dia risultati validi per tutta la popolazione

13 Principio del panel test Questo tipo di test è basato sulle capacità di un gruppo di assaggiatori, di solito 10, allenati all'apprezzamento delle caratteristiche olfattivo - gustative degli oli vergini, che subito dopo aver assaggiato un campione compilano una scheda guida, in modo separato ed autonomo, ed accertano la presenza e l'intensità delle sensazioni di base (pregi e difetti). Studi hanno evidenziato che gli organi sensoriali umani si comportano come dei veri e propri strumenti di misura: l'analisi sensoriale! Si è accertato che per un determinato aroma anche gli organi sensoriali umani rispondono molto bene come strumenti per il riconoscimento del tipo di percezione; per quanto riguarda invece l'intensità di percezione, sono state fatte delle prove per determinare le cosiddette soglie di percezione

14 Necessità di più assaggiatori La differenza di valutazione fatta da individui differenti, in merito allintensità di percezione per la stessa sostanza - stimolo, costituiva un impedimento all'utilizzo di una sola persona nelle valutazioni delle caratteristiche organolettiche degli alimenti in quanto il tipo di giudizio fornito non poteva essere ritenuto obiettivo e quindi non ripetibile: da qui la necessità di affidare l'analisi a un gruppo (panel) di persone guidate (capo panel) e preparate appositamente per effettuare una analisi sensoriale la più attendibile e ripetibile possibile

15 Come si effettua il panel test La degustazione stimola sia l'olfatto sia il gusto e quindi l'assaggiatore deve seguire alcune norme comportamentali prima dellassaggio: Il periodo più adatto e indicato sono le prime ore del mattino, l'ambiente ideale per l'assaggio è un luogo chiuso, non freddo, a luce naturale, in assenza completa di odori. Gli assaggiatori devono essere in condizioni fisiologiche e psicologiche corrette, tali da non compromettere la prova non fumare almeno 30 minuti prima dell'assaggio non fumare almeno 30 minuti prima dell'assaggio non usare alcun profumo, sapone o cosmetico il cui odore persista al momento della prova non usare alcun profumo, sapone o cosmetico il cui odore persista al momento della prova non aver ingerito alcun alimento fino ad almeno un'ora prima dell'assaggio non aver ingerito alcun alimento fino ad almeno un'ora prima dell'assaggio

16 La cabina dassaggio In ogni cabina d'assaggio è presente un lavandino, dato che gli assaggiatori non deglutiscono il campione in esame (come per il vino), ed i campioni da esaminare (max 8 a seduta), sono in un recipiente che li mantiene alla temperatura ideale di 28°C; questa temperatura è ottimale perchè a temperature inferiori l'olio non volatilizza portando ad una scarsa osservazione delle caratteristiche organolettiche, mentre a temperature superiori l'olio acquista volatilizzando aromi tipici degli oli riscaldati. Inoltre l'assaggiatore tra una prova e l'altra deve mangiare uno spicchio di mela verde e bere acqua frizzante per ripulire le papille gustative per non influenzare le prove successive con il gusto degli oli precedenti

17 La degustazione La prova è divisa in due fasi : la degustazione olfattiva e l'assaggio. Inoltre è importante anche laspetto visivo

18 Espressione dei risultati I risultati della degustazione sono espressi con un diagramma a stella, in cui ogni parametro è indicato su una scala da 0 a 6

19 Classificazione merceologica In base ai voti del panel test, lolio è classificato nella categoria merceologica più adatta C.O.I.: Consiglio Oleicolo Internazionale

20 Analisi sullolio doliva Le analisi che vengono effettuate sui campioni di olio si dividono in tre categorie: analisi che accertano la qualità dell'olio: sono i saggi di acidità, dei perossidi, l'analisi UV, la composizione acidica, la composizione sterolica, il contenuto di solventi alogenati e lanalisi gascromatografica; analisi che accertano la qualità dell'olio: sono i saggi di acidità, dei perossidi, l'analisi UV, la composizione acidica, la composizione sterolica, il contenuto di solventi alogenati e lanalisi gascromatografica; analisi che accertano la conservabilità dell'olio: numero di perossidi, analisi UV, acidità, panel test, tempo di induzione; analisi che accertano la conservabilità dell'olio: numero di perossidi, analisi UV, acidità, panel test, tempo di induzione; analisi che accertano la genuinità dell'olio: composizione acidica, sterolica, analisi UV, analisi dei solventi alogenati, differenza ECN 42 HPLC e ECN 42 calcolo teorico analisi che accertano la genuinità dell'olio: composizione acidica, sterolica, analisi UV, analisi dei solventi alogenati, differenza ECN 42 HPLC e ECN 42 calcolo teorico I parametri analitici determinati sullolio e le tecniche utilizzate sono descritti nel regolamento CEE n. 2568/91 e successive modifiche

21 Parametri analitici importanti I principali parametri determinati sullolio sono i seguenti: Acidità libera – la quantità di acidi grassi liberi (non esterificati) Acidità libera – la quantità di acidi grassi liberi (non esterificati) Numero di perossidi – la potenzialità ossidativa di un olio Numero di perossidi – la potenzialità ossidativa di un olio Polifenoli – la quantità totale di composti polifenolici Polifenoli – la quantità totale di composti polifenolici Tocoferoli – la quantità di composti aventi struttura analoga alla vitamina E Tocoferoli – la quantità di composti aventi struttura analoga alla vitamina E Acidi grassi dei gliceridi – indice di genuinità e tipicità Acidi grassi dei gliceridi – indice di genuinità e tipicità Steroli – utile per accertare sofisticazioni Steroli – utile per accertare sofisticazioni Parametri UV – per identificare adulterazioni con altri oli Parametri UV – per identificare adulterazioni con altri oli

22 Tabella olio extravergine

23 Tabella bis

24 Acidità libera Questa analisi esprime la percentuale di acidi grassi liberi presente nel prodotto. Gli acidi liberi si riscontrano soltanto dopo l'estrazione dell'olio dal frutto, poiché all'interno del frutto sono neutri. Essi derivano come prodotto di alcune reazioni innescate da enzimi lipolitici, durante la maturazione del frutto o a causa di una cattiva conservazione del frutto. Proprio per questo motivo l'analisi dell'acidità viene considerata come parametro per stabilire la qualità di un olio di oliva Dal punto di vista analitico si tratta di una titolazione acido-base effettuata in soluzione organico con idrossido di potassio come titolante e fenolftaleina come indicatore. Convenzionalmente, lacidità è espressa come percentuale di acido oleico anche se è dovuta a numerosi composti La presenza elevata di questi acidi grassi liberi (superiori al 3-4%) rende un olio non commestibile poiché avrebbero un'azione irritante sulla mucosa gastroenterica oltre che una sgradevole sensazione in bocca I sistemi di trasporto e di stoccaggio delle olive possono alterare il valore di acidità, se risultano essere promotori di processi di fermentazione. Per questo motivo, devono essere minimi i tempi che intercorrono fra la raccolta dei frutti e la loro lavorazione

25 Numero di perossidi Questa analisi esprime la quantità di ossigeno già assorbita dall'olio, il quale quindi ha già iniziato una propria attività ossidativa che durante l'invecchiamento porta ad un irrancidimento del prodotto che ne conferisce odori e sapori sgradevoli. Attraverso questa analisi possiamo quindi determinare la potenzialità ossidativa di un olio di oliva: più alto è il suo valore e più avanzato è lo stadio di irrancidimento del prodotto Come per l'acidità libera, per il numero di perossidi la conservazione può influenzare negativamente questo valore, favorendo un veloce e precoce irrancidimento del prodotto; in particolare il parametro si può alterare: Analiticamente, il numero di perossidi è il quantitativo di sostanze presenti nel campione, espresse in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg, che ossidano lo ioduro di potassio in condizioni standard. Si tratta di una titolazione redox nella quale lo iodio liberato è titolato con una soluzione di tiosolfato di sodio a concentrazione nota in presenza di indicatore amido, che forma un complesso colorato con lo iodio A + 2I - B + I 2 I 2 + 2S 2 O 3 2 - 2I - + S 4 O 6 2- se le olive sono sovramature, schiacciate e tenute in magazzini non adatti; se le olive sono sovramature, schiacciate e tenute in magazzini non adatti; se una prolungata lavorazione promuove l'azione enzimatica e fa aumentare lossidazione; se una prolungata lavorazione promuove l'azione enzimatica e fa aumentare lossidazione; per l'esposizione del prodotto alla luce e/o ad elevate temperature; per l'esposizione del prodotto alla luce e/o ad elevate temperature; per contenitori e/o ambienti non idonei per contenitori e/o ambienti non idonei

26 Analisi UV Lanalisi di un olio mediante spettrofotometria UV- visibile è effettuata correntemente per la valutazione della sua genuinità e per identificare eventuali adulterazioni. Si tratta di un procedimento di semplice esecuzione, anche per la grande diffusione degli spettrofotometri UV-visibile nei laboratori chimici Questo tipo di analisi è espresso mediante dei coefficienti K che rappresentano l'assorbimento da parte dell'olio all'esposizione di luce ultravioletta in particolari condizioni. Lassorbimento di luce di una sostanza è regolato dalla legge di Lambert-Beer

27 Legge di Lambert-Beer A = bC A = Assorbanza = Log (I o /I) I = Intensità di emissione di una sorgente = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare, lassorbanza di una soluzione 1M = assorbività molare o coefficiente di estinzione molare, lassorbanza di una soluzione 1M b = cammino ottico C = concentrazione della sostanza che assorbe la luce I0I0I0I0 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~ ~~~~~~~~~~~~~~~~~~ I Sorgente di emissione Rivelatore Campione b I0I0I0I0 I0I0I0I0

28 Spettrofotometro UV-visibile Uno strumento che effettua analisi con tecniche spettroscopiche si chiama genericamente spettrofotometro ed è composto dalle seguenti parti: Il monocromatore è un sistema che permette di selezionare o filtrare le che arrivano dopo il campione Comparto del campioneMonocromatore Rivelatore Sorgente di emissione al PC

29 Esempio di spettrofotometro Gli spettrofotometri UV-visibile sono estremamente diffusi per la loro semplicità di utilizzo e versatilità e per il basso costo. Quasi tutte le sostanze organiche presentano assorbimenti nel range strumentale (180-800 nm)

30 Spettro di assorbimento Il campione è irraggiato con un intervallo più o meno ampio di ; le assorbite, aventi energia sufficiente a promuovere transizioni elettroniche, corrispondono ai gruppi funzionali delle molecole. La risposta è visibile sotto forma di spettro di assorbimento Assorbanza

31 Esecuzione dellanalisi UV L'esame UV viene condotto sull'olio disciolto in opportuno solvente (cicloesano o isoottano) nell'intervallo compreso tra 220 e 280 nm. Le lunghezze d'onda più significative sono 232, 262, 268 e 274 nm. I valori di assorbimento vengono espressi come assorbanza specifica o coefficiente di estinzione molare, intendendo con questa espressione l'assorbanza ad una certa lunghezza d'onda di una soluzione all'1 % dell'olio in esame nel solvente prescelto, osservata in una cella dello spessore di 1 cm Per quanto riguarda il solvente, il Metodo Ufficiale indica l'isoottano, mentre in passato era usato generalmente il cicloesano

32 Espressione dei risultati Nellanalisi UV dellolio si usa esprimere l'assorbanza specifica con la lettera K. Ad esempio K 268 indica l'assorbanza specifica dell'olio in esame alla lunghezza d'onda di 268 nm K 268 = A (1 cm/1%(268 nm)) = A 268 / C *b dove A 268 è il valore dell'assorbanza a 268 nm della soluzione dell'olio in esame, C la concentrazione della soluzione espressa in g/100 ml e b lo spessore in cm della cella di quarzo nella quale viene esaminata la soluzione dell'olio in esame

33 Significato dellanalisi UV Il coefficiente di estinzione molare alle lunghezze d'onda di 230 nm e 270 nm, indica lo stato ossidativo dell'olio, poiché si possono formare dieni e trieni coniugati durante l'ossidazione del prodotto. I doppi legami nellolio vergine non sono mai vicini o coniugati. La presenza di doppi legami coniugati è dovuta allazione ossidativa di alcuni reagenti (NaOH) impiegati fraudolentemente, che causa lo slittamento dei doppi legami. Questo slittamento comporta un assorbimento caratteristico all'ultravioletto attorno a 270 nm dove si ha un picco in presenza di olio rettificato (olio di sansa e semi) per la presenza di dieni formatisi per slittamento Gli acidi linoleico e linolenico sono utili al fine di distinguere l'olio vergine da quello raffinato, perchè hanno rispettivamente 2 e 3 doppi legami Acido linoleico Acido linolenico

34 Spettro UV di oli adulterati Lanalisi UV, oltre a fornire utili elementi di giudizio sulla qualità di un olio, ha permesso di risolvere definitivamente il problema del riconoscimento dell'olio rettificato eventualmente aggiunto all'olio di oliva vergine, sfruttando il fatto che gli oli naturali di pressione non contengono doppi legami coniugati che invece si formano, sia pure in misura minima, durante la rettifica, particolarmente nella fase di decolorazione su terre attive Ne consegue che i rettificati presentano valori di assorbimento nell'UV, particolarmente nella zona intorno ai 270 nm, notevolmente superiori a quelli dei vergini La formazione di idroperossidi in acidi grassi polinsaturi provoca uno slittamento del doppio legame con formazione di un sistema dienico coniugato che assorbe a 232 nm

35 Frodi riconoscibili con UV La spettrofotometria UV permette di individuare se un olio d'oliva sia vergine e di classificarlo commercialmente; di individuare un olio d'oliva proveniente da un processo di raffinazione; di riconoscere una miscela tra un olio d'oliva vergine e un qualsiasi tipo di olio raffinato

36 Polifenoli I polifenoli sono sostanze antiossidanti e, se presenti in elevata concentrazione, costituiscono un pregio per lolio. Non sono previsti indici limiti di legge, ma il loro valore dà indicazioni sulla qualità del prodotto Chimicamente sono composti con uno o più gruppi ossidrilici o fenolici, in grado di reagire con ossigeno libero in modo da ridurne la capacità ossidante, che danneggerebbe, cioè invecchierebbe, cellule e tessuti L'analisi è eseguita mediante la spettrofotometria UV-visibile. Si utilizza il reattivo di Folin-Ciocalteau (miscela di acido fosfotungstico, H 3 PW 12 O 40, e acido fosfomolibdico, H 3 PMo 12 O 40 ) che in presenza di composti fenolici si riduce a miscela di ossidi di tungsteno e molibdeno (W 8 O 23 e Mo 8 O 23 ); la colorazione blu sviluppata ha un massimo di assorbimento a 750 nm. Convenzionalmente il risultato della misura spettrofotometrica si esprime in mg di acido gallico per litro di olio Acido gallico Idrossitirosolo Oleuropeina

37 Tecniche cromatografiche Tra le tecniche più idonee allanalisi di campioni agroalimentari vi sono le cosidette tecniche cromatografiche, utilizzate per separare e identificare singolarmente i componenti di una miscela. Il termine deriva dal greco ed è legato al suo inventore, un botanico russo di nome Tzwett, che allinizio del XX secolo intendeva separare le sostanze coloranti della clorofilla Queste tecniche sono molto varie, ma si basano tutte su un principio comune: esse sfruttano la differenza di interazione dei componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la fase fissa o stazionaria, e di un supporto dinamico, la fase mobile o eluente, che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze componenti la miscela. Durante lattraversamento, detto processo di eluizione, i componenti subiscono un rallentamento più o meno marcato a seconda della loro affinità per la fase fissa ed escono da essa a tempi diversi, in modo da poter essere identificati uno per uno. Le sostanze che compongono la miscela vengono identificate mediante un rivelatore posto alluscita dalla fase fissa che registra le modifiche di alcune proprietà chimico-fisiche. Il responso che si ottiene si chiama cromatogramma

38 Tecniche cromatografiche I due gruppi principali di tecniche cromatografiche sono: la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida

39 Nella cromatografia liquida (LC) la fase fissa è una colonna o un supporto planare contenente il materiale attivo, la fase mobile è un liquido; essa è utilizzata per la separazione di sostanze poco volatili come idrocarburi ad alto peso molecolare, molecole biologiche (proteine, grassi), sostanze ioniche o ionizzabili (anioni, amine, zuccheri) Cromatografia liquida Assai usate sono la cromatografia ad alta pressione o HPLC per la separazione di sostanze neutre e la cromatografia ionica (IC) per la separazione di sostanze ioniche

40 Esempio di cromatogramma Un esempio di analisi IC si ha nella figura sottostante, nella quale è mostrata la separazione e identificazione di acidi carbossilici nel vino

41 Gascromatografia Nella gascromatografia (GC) la fase fissa è una colonna contenente il materiale attivo e la fase mobile è un gas; essa è utilizzata per la separazione di sostanze volatili o volatilizzabili come idrocarburi a basso peso molecolare, aromi, acidi organici. Tra le varie versioni, particolarmente utilizzata in campo agroalimentare è la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) che consente di avere informazioni strutturali sulle sostanze separate

42 Strumenti per gascromatografia

43 cromatogramma tempo di ritenzione spettro di massa m/z Esempio di cromatogramma GC-MS

44 Esempio di cromatogramma GC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1=colesterolo 2=brassicasterolo3=24 metilencolesterolo 4=campesterolo 5=campestanolo 6=stigmasterolo7= 7 campesterolo 8= 5,23stigmastadienolo 9=clerosterolo 10=sitosterolo 11=sitostanolo 12= 5 avenasterolo 13= 5,24 stigmastadienolo 14= 7 stigmasterolo 15= 7 avenasterolo 16=eritrodiolo17=uvaolo I.S. 14 15 16 17

45 Tocoferoli Anche i tocoferoli sono sostanze antiossidanti e possono costituire un pregio per lolio. Non sono previsti indici o limiti di legge. Sono composti antiossidanti di struttura analoga alla vitamina E e sono presenti in quasi tutte le sostanze grasse: la protezione dallossidazione esercitata dai tocoferoli nei riguardi del grasso, è dovuta al fatto che questi composti sono L'analisi dei tocoferoli è eseguita con un metodo che fa uso della cromatografia liquida ad alta risoluzione (HPLC). Il metodo separa e determina quantitativamente i tocoferoli naturali nelle varie forme isomeriche e l'alfa-tocoferil acetato. Il sistema cromatografico impiegato fa uso di una colonna RP-18, di una fase mobile costituita da metanolo/acqua (96:4) e di un rivelatore spettrofotometrico UV a lunghezza d'onda 288 nm -tocoferolo (vitamina E) -tocoferolo (vitamina E) facilmente ossidabili, catturando i radicali liberi che si formano durante l'ossidazione all'aria dei composti insaturi, ed ha le stesse funzioni sia nei cibi che nel tessuto cellulare La vitamina E, che si trova nella frazione insaponificabile degli oli, è importante come antiossidante, promuove l'utilizzazione della Vitamina A e la sintesi dell'eme; essa è inoltre usata come coadiuvante nell'aterosclerosi e nella sterilità, ed è un noto antiabortivo

46 Esempi di analisi di tocoferoli Lattività antiossidante dei tocoferoli li rende molto reattivi e quindi facilmente degradabili ai loro prodotti ossidati. Il contenuto nellolio è destinato a calare in breve tempo, come si vede dal grafico Alcuni esempi di separazioni HPLC di oli sono riportati nelle figure sottostanti

47 L'importanza della determinazione analitica dei grassi è dovuta al fatto che da una sola procedura viene ricavata una notevole quantità di parametri, che sono peraltro specifici, cioè corrispondono a singoli componenti chimici presenti in un olio. La composizione acidica può rappresentare quindi un indice di genuinità e tipicità di un olio Gli acidi grassi sono presenti nellolio in forma libera, meno desiderabile, oppure in forma esterificata con la glicerina nei gliceridi, la materia nobile dellolio di oliva che ne costituisce circa il 98% Acidi grassi

48 La maggior parte degli acidi grassi è a catena lineare con un numero pari di atomi di carbonio. Possono essere presenti doppi legami (acidi insaturi); se cè più di un doppio legame (fino a 6) si parla di polieni; ci sono anche tripli legami Oltre alla catena lineare più o meno insatura, possono esserci gruppi funzionali sostituenti come cheto (=CO), idrossi (-OH), epossi (-O-) presenti naturalmente o indotti da processi tecnologici Alcuni acidi grassi sono specifici di determinate piante (erucico, petroselinico) e quindi la loro identificazione è indice di adulterazione Acidi grassi nellolio Acido stearico (C18, o doppi legami) Acido oleico (C 18, 1 doppio legame) Acido linoleico (C 18, 2 doppi legami) Acido linolenico (C 18, 3 doppi legami)

49 La determinazione degli acidi grassi esterificati è eseguita mediante GC. Gli acidi grassi dei gliceridi vengono trasformati, mediante transesterificazione, nei rispettivi esteri metilici, che presentano una maggiore volatilità ed una minore polarità rispetto ai corrispondenti acidi liberi; i gliceridi hanno invece scarsa volatilità Gli acidi grassi metilati vengono iniettati in colonna e separati come tali. Questa determinazione fornisce quindi la composizione acidica in esteri metilici anzichè in acidi liberi; in pratica, la differenza tra le due composizioni è abbastanza piccola e comunque tutti i valori tabulati di riferimento sono basati sui metilati, quindi non si ha alcuna incertezza di attribuzione L'identificazione dei singoli acidi avviene mediante cromatogrammi eseguiti su standard Determinazione degli acidi grassi

50 La Acidi nellolio di oliva

51 Acidi nellolio di arachidi

52 Acidi nellolio di colza

53 Acidi nellolio di Ribes nigra

54 Acidi nellolio di pesce

55 Due parametri che si determinano frequentemente ma che sono di minore importanza sono il numero di saponificazione e il numero di iodio Il numero di saponificazione (SN) è un dato analitico standard legato al peso molecolare degli acidi grassi: equivale al peso in mg di KOH necessario per idrolizzare 1 g di olio in condizioni standard. Maggiore è il valore di SN, minore è il peso molecolare medio degli acidi grassi liberi contenuti nellolio. Siccome lintervallo di variazione di SN è abbastanza ristretto per la maggior parte degli oli, non risulta essere significativo Il numero di iodio (IN) esprime lammontare di acidi grassi insaturi in un olio, correlato al numero di doppi legami C=C facenti parte delle molecole di acidi. La misura si effettua determinando la quantità di iodio che può dare addizione elettrofila sui doppi legami, secondo la reazione Si esprime in g di I 2 necessari per 100 g di olio. I valori sono tipici per ogni acido grasso, es. acido oleico (1 doppio legame) 89.9, acido linoleico (due doppi legami) 181, acido linolenico (3 doppi legami) 273 Parametri classici

56 Dal punto di vista del riconoscimento di adulterazioni, la determinazione degli acidi grassi in molti casi non dà risposte chiare, sia perchè tra gli oli di oliva vi sono variazioni dovute allorigine geografica, sia perchè alcuni oli vegetali hanno composizione molto simile dal punto di vista dei componenti della frazione saponificabile. Ad esempio, ladulterazione dellolio di oliva con olio di colza, girasole o nocciolo non può essere rivelata con lanalisi degli acidi grassi L'analisi della frazione insaponificabile è invece uno dei metodi più accurati per accertare la sofisticazione dell'olio di oliva. In particolare, la composizione degli steroli è strettamente correlata alla specie vegetale di origine, e meno allorigine geografica e al trattamento del prodotto (olio di oliva vergine, olio di sansa, olio rettificato, ecc.) Analisi della frazione non saponificabile

57 Tra tutti i componenti della frazione insaponificabile si studiano principalmente gli steroli, composti organici che caratterizzano qualitativamente e quantitativamente le differenti sostanze grasse è quindi tetraciclica, con numero di atomi di carbonio da 27 a 30, ed è caratterizzata da un gruppo ossidrilico in posizione 3 e uno o più doppi legami. Il sostituente in posizione 17 può essere costituito da un numero variabile di atomi di carbonio e può portare una funzione acida, chetonica, ecc. Si tratta di sostanze biologicamente molto importanti: basta pensare allattività fisiologica del colesterolo, il più noto tra gli steroli, che tra laltro è anche il precursore di molti ormoni steroidei Gli steroli sono alcoli o esteri degli steroidi, un importante e vasto gruppo di composti presenti nei tessuti animali e vegetali, caratterizzato dalla presenza nella molecola di un concatenamento di atomi di carbonio identico a quello del fenantrene, fuso a un anello pentenico. La struttura della molecola Gli steroli

58 La determinazione della frazione sterolica totale e dei singoli steroli è indispensabile nellanalisi dellolio doliva. I motivi sono da ricercarsi nel fatto che la frazione sterolica non è influenzabile da variazioni genetiche, che invece possono mutare radicalmente la componente saponificabile e quella degli acidi grassi. La sofisticazione dellolio è quindi rilevabile facilmente in base al tipo di steroli identificati Tra gli steroli dellolio, il -sitosterolo (sx) costituisce circa l'80% del totale; altri composti sterolici importanti sono il colesterolo (dx), lo stigmasterolo, il campesterolo e lavenasterolo -sitosterolo colesterolo -sitosterolo colesterolo Steroli nellolio

59 La determinazione degli steroli si effettua per GC. Lanalisi non è possibile sul campione tal quale, ma va fatta su un estratto purificato della frazione insaponificabile, ottenuto mediante due passaggi successivi Il campione di olio (addizionato di -colestanolo come standard interno) è sottoposto a saponificazione con KOH in soluzione etanolica; l'insaponificabile è estratto con etere etilico e recuperato dopo la separazione di fase Dallestratto la frazione sterolica è separata mediante cromatografia su strato sottile, utilizzando gel di silice basica e fase eluente benzene- acetone 95:5. Le bande dei vari composti sono evidenziate spruzzando la lastra con 2,7-diclorofluoresceina; gli steroli sono poi recuperati dal gel di silice mediante raschiamento Siccome gli steroli non sono sufficientemente volatili per essere separati con la GC, dopo il recupero dalla lastrina TLC è necessaria la loro derivatizzazione in eteri trimetilsililici; la reazione avviene con trimetilsilil cloruro (CH 3 ) 3 Si-Cl in piridina: R-OH + (CH 3 ) 3 Si-Cl RO-Si(CH 3 ) 3 Determinazione degli steroli

60 Separazione TLC Separazione su strato sottile della frazione insaponificabile, effettuata con miscela benzene-acetone 95:5 idrocarburi squalene tocoferoli terpeni alcoli steroli eritrodiolo + uvaolo linea di deposizione

61 Separazione TLC Passaggi della separazione con TLC: 1)deposizione del campione sulla lastra 2)Evidenziamento delle bande 3)Esame UV delle bande

62 Schema generale olio frazione eterea frazione acquosa INSAPONIFICABILE saponi TLC steroli GLC KOH etere etilico

63 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 I.S 14 15 16 17 Analisi GC degli steroli 1.Colesterolo 2.Brassicasterolo 3.24 metilencolesterolo 4.Campesterolo 5.Campestanolo 6.stigmasterolo 7. 7-campesterolo 8. 5,23-stigmastadienolo 9.Clerosterolo 10.Sitosterolo 11.Sitostanolo 12. 5-avenasterolo 13. 5,24-stigmastadienolo 14. 7-stigmasterolo 15. 7-avenasterolo 16.Eritrodiolo 17.Uvaolo I.S.Standard interno

64 La tabella seguente riporta la distribuzione % dei singoli steroli in oli di varia origine vegetale. Essa mostra che ladulterazione dellolio di oliva con oli diversi ne altera il profilo sterolico in maniera chiaramente rivelabile Ad esempio, laddizione di olio di girasole innalza fortemente il tasso di 7 -stigmasterolo; la presenza di olio di colza è svelata dalla quantità eccessiva di brassicasterolo, un composto tipico delle Crucifere. Anche il colesterolo può essere indicativo di adulterazione, essendo elevato il suo contenuto in grassi animali e nellolio di palma Composizione sterolica degli oli

65 Lidentificazione di adulterazioni si può effettuare anche con una tecnica meno esigente dal punto di vista della preparazione del campione: la risonanza magnetica nucleare o NMR Questa tecnica analitica è estremamente potente e la sua applicazione rappresenta il futuro nellanalisi agroalimentare (e non solo). Essa presenta alcuni notevoli vantaggi tra cui: Il rovescio della medaglia è che la strumentazione ha costi assolutamente proibitivi (uno spettrometro NMR di basso livello può costare 300.000 ), per cui limpiego è limitato a grossi centri di ricerca o laboratori di analisi con un fatturato annuo elevatissimo Analisi NMR dellolio Possiamo ottenere informazioni quantitative riguardo a numerose specie chimiche con un singolo esperimento Possiamo ottenere informazioni quantitative riguardo a numerose specie chimiche con un singolo esperimento Lerrore sperimentale per tutti i composti analizzati è lo stesso Lerrore sperimentale per tutti i composti analizzati è lo stesso Il campione è analizzato direttamente, senza estrazioni o altri trattamenti Il campione è analizzato direttamente, senza estrazioni o altri trattamenti

66 Questa tecnica analitica è da ormai 50 anni la più utilizzata nel campo della caratterizzazione della struttura di sostanze organiche Per comprendere bene i principi su cui si basa, è necessario descrivere i meccanismi del nucleo dellatomo. Gli atomi che hanno nel nucleo un Risonanza Magnetica Nucleare Numero di protoni Numero di neutroni Numero di Spin Esempi pari 0 12 C, 16 O, 32 S disparipari1/2 1 H, 19 F, 31 P disparipari3/2 11 B, 35 Cl, 79 Br paridispari1/2 13 C paridispari3/2 127 I paridispari5/2 17 O dispari 1 2 H, 14 N numero dispari di protoni o di neutroni (o di entrambi) hanno un numero di spin non nullo Alcuni esempi di specie con numero di spin nullo o non nullo sono riportati nella tabella

67 Quando un nucleo con numero di spin non nullo è posto in un campo magnetico, lo spin nucleare può allinearsi alla direzione del campo oppure alla direzione opposta A questi due allineamenti sono associate energie differenti: in particolare, lo stato con spin opposto è più energetico Stati di spin Lo spinning del nucleo genera un campo magnetico con momento magnetico proporzionale allo spin In presenza di un campo magnetico esterno (B 0 ), si generano due stati energetici con spin +½ e -½

68 La differenza in energia tra i due stati di spin dipende dal campo magnetico esterno applicato. Come si vede dal grafico, i due stati di spin hanno la stessa energia per B 0 = 0, ma divergono man mano che il campo aumenta. Tuttavia, la differenza è sempre molto bassa e sono necessari campi magnetici molto forti per evidenziarla Effetto del campo magnetico

69 Questa piccola differenza di energia (DE) è normalmente indicata come frequenza in unità di MHz (10 6 Hz). A seconda del tipo di nucleo studiato e del campo magnetico applicato, si considerano frequenze nel range 20- 900 Mhz Principio della spettrometria NMR Irradiando un campione con energia corrispondente esattamente a quella richiesta per permettere la transizione tra i due stati di spin per un nucleo specifico, si avrà lassorbimento della radiazione da parte del campione. Questa energia è nel campo delle radiofrequenze; si tratta della radiazione meno energetica tra quelle utilizzate dalle tecniche analitiche Operativamente si pone il campione in un campo magnetico variabile e si registra il valore di campo magnetico al quale avviene lassorbimento energetico che causa la transizione di spin

70 Lambiente elettronico attorno ad un determinato nucleo tende a formare un campo magnetico che si oppone come uno schermo al campo applicato esternamente, influenzando così lesatta energia di transizione di spin in quanto il campo esterno deve essere leggermente incrementato per permettere la transizione Schermo elettronico In conseguenza di ciò, nuclei posti in situazione elettroniche diverse daranno segnali di assorbimento NMR (o risonanza) diversi e questa è la base per poter riconoscere parti diverse allinterno di una molecola, permettendo di determinarne la struttura

71 Schema di uno spettrometro NMR

72 Il campo magnetico interno, dovuto allo schermo elettronico, è di forza molto minore rispetto a quello esterno. Normalmente si indicano in ppm (parti per milione) gli incrementi di campo che è necessario applicare nelle varie situazioni per avere lassorbimenti della radiazione a radiofrequenza Tuttavia, mentre nelle spettroscopie molecolari (UV, IR) gli assorbimenti corrispondono ad energie univocamente definite da una frequenza o una lunghezza donda, la posizione dei segnali di risonanza NMR dipende sia dalla radiofrequenza utilizzata, sia dal campo magnetico applicato, rendendo difficoltoso confrontare spettri ottenuti con strumenti diversi Chemical shift Per questo motivo, si è soliti riportare i segnali NMR in uno spettro in relazione ai segnali di una sostanza di riferimento addizionata al campione. Relativamente allanalisi dei nuclei di H e C (i più importanti nel campo biochimico e organico), il composto utilizzato è il tetrametilsilano (TMS); le differenze dei segnali del campione rispetto ai segnali del TMS sono chiamate chemical shifts, sono espresse in ppm e sono indicate come Per questo motivo, si è soliti riportare i segnali NMR in uno spettro in relazione ai segnali di una sostanza di riferimento addizionata al campione. Relativamente allanalisi dei nuclei di H e C (i più importanti nel campo biochimico e organico), il composto utilizzato è il tetrametilsilano (TMS); le differenze dei segnali del campione rispetto ai segnali del TMS sono chiamate chemical shifts, sono espresse in ppm e sono indicate come tetrametilsilano

73 Chemical shift: esempi Composto (CH 3 ) 4 C 0.9 (CH 3 ) 4 Si 0.0 (CH 3 ) 3 N 2.1 (CH 3 ) 3 P 0.9 (CH 3 ) 2 O 3.2 (CH 3 ) 2 S 2.1 CH 3 F 4.1 CH 3 Cl 3.0

74 In questa scala, il segnale del protone nel TMS ha = 0

75 Esempio di spettro 1 H NMR Spettro NMR protonico dellacido dimetilbenzoico

76 Esempio di spettro 13 C NMR Spettro NMR della canfora

77 Lo spettro NMR di una sostanza pura è sufficientemente semplice da permettere lassegnazione di tutti i segnali dello spettro, risolvendo così la struttura di un composto incognito Diversa è, naturalmente, la situazione in un campione reale dove possono essere presenti decine o centinaia di sostanze diverse, ognuna delle quali può dare più segnali. In questo caso è necessario disporre di uno strumento ad alto campo magnetico, per permettere di evidenziare le differenze minime dei segnali da molecola a molecola Spettro NMR di un campione reale Spettro protonico dellolio di oliva. Il numero elevato di composti organici presenti nellolio rende lo spettro NMR di difficile interpretazione; è necessario isolare sezioni definite dello spettro e studiarne le caratteristiche da campione a campione

78 Strumento: spettrometro NMR Bruker AVANCE AQS, 600.13 MHz Strumento: spettrometro NMR Bruker AVANCE AQS, 600.13 MHz Preparazione del campione: 20 µl di olio di oliva in una miscela di solventi (700 µl CDCl 3 + 20 µl DMSO-d 6 ) Preparazione del campione: 20 µl di olio di oliva in una miscela di solventi (700 µl CDCl 3 + 20 µl DMSO-d 6 ) Temperatura: 25°C Temperatura: 25°C Durata dellesperimento: 4 h Durata dellesperimento: 4 h Spettro 1 H di un olio di oliva

79 Ingrandimento

80 olio di arachidi olio di girasole Regione dei CH 3 olio di oliva extravergine olio di oliva olio di soia olio di mais -sitosterolo -sitosterolo acido linolenico

81 acido linoleico olio di oliva extravergine olio di oliva olio di girasole olio di mais olio di soia olio di arachidi Regione dei CH 3

82 esanaleesenale olio di oliva extravergine olio di oliva olio di girasole olio di mais olio di soia olio di arachidi Regione delle aldeidi

83 Attributi sensoriali Olio amaro Olio avvinato Cattiva separazione dalle acque di vegetazione Olio pungente Olio fruttato

84 olio extravergine olio amaro Olio amaro - zona dei doppi legami

85 olio extravergine olio amaro extravergine Olio amaro - zona dei terpeni

86 olio avvinato olio extravergine Olio avvinato acetati

87 olio extravergine olio rancido Olio rancido

88 olio extravergine olio riscaldato Olio riscaldato

89 olio siciliano olio umbro Caratterizzazione geografica

90 Addizione di olio di nocciola Dalle nocciole fresche si ottiene un olio la cui composizione è molto simile a quella dellolio di oliva; si tratta di un olio di elevato pregio ed alto valore commerciale ed in tali condizioni risulta non conveniente addizionare lolio di nocciola ad un olio di oliva di qualità Tuttavia il surplus di nocciole vecchie ed ammuffite viene usato per produrre un olio scadente che contiene micotossine cancerogene; questolio, opportunamente deodorizzato, viene aggiunto ad oli di oliva scadenti (Turchia, Tunisia) e messo in commercio Questa è una FRODE di difficile individuazione

91 Riconoscimento mediante analisi NMR * olio di nocciola acidi grassi saturi acido linolenico olio di oliva olio di nocciola

92 Preparazione dei campioni: 100 µl di olio di oliva in 600 µl di CHCl 3Preparazione dei campioni: 100 µl di olio di oliva in 600 µl di CHCl 3 Durata dellesperimento: 15 minDurata dellesperimento: 15 min Spettro 13 C di un olio di oliva

93 Caratterizzazione genetica ( 13 C) Attraverso lanalisi statistica degli spettri NMR 13 C, è possibile distinguere oli prodotti con cultivar diverse di olive

94 Analisi isotopica dellolio di oliva Oltre allanalisi NMR, unaltra tecnica molto sofisticata per la caratterizzazione dellolio di oliva è lanalisi isotopica che si effettua mediante la spettrometria di massa per quanto riguarda H, C, O, N ed S; la determinazione del rapporto isotopico D/H si effettua prevalentemente con la tecnica NMR I rapporti isotopici 13 C/ 12 C e 18 O/ 16 O sono utilizzati per distinguere oli di oliva provenienti da regioni geografiche diverse ( ) Spagna; ( ) Marocco; ( ) Grecia; ( ) Tunisia; ( ) Turchia; ( ) Italia ( ) Italia – regioni interne ( ) Italia - regioni costiere

95 Laroma dellolio Analogamente allo spettro aromatico del vino, anche nellolio di oliva le varie note individuabili in fase di degustazione sono riconducibili alla presenza di sostanze volatili attive a concentrazioni più o meno alte

96 Sostanze aromatiche Alle sostanze aromatiche appartengono classi di composti molto diverse le una dalle altre come alcoli (in particolare terpeni), aldeidi, chetoni, esteri, acidi o semplici idrocarburi Si tratta generalmente di composti di piccole dimensioni e aventi alta tensione di vapore, ovvero tendenza a passare in fase vapore: per questo motivo entrano facilmente in contatto con le cellule olfattive sollecitando una sensazione odorosa. Sono questi composti che contribuiscono al profumo dellolio o, da un punto di vista più negativo, sono anche quelli che possono indicare la presenza di un eventuale difetto Limonene

97 Sostanze aromatiche Le sostanze responsabili dellaroma dellolio sono numerosissime, come si può notare dalla figura sottostante

98 Origine delle sostanze aromatiche Le sostanze aromatiche dellolio derivano in gran parte dalla degradazione di acidi grassi poliinsaturi (cioè aventi due o più doppi legami nella catena alchilica) presenti nelle olive, attraverso una catena di reazioni enzimatiche nota come lipossigenasi che avviene durante il processo di estrazione dellolio Dalla degradazione dellacido linoleico (C18:2) possono derivare quantità variabili di esanale, esanolo e acetato di esile, mentre dallacido linolenico (C18:3) derivano cis- 3-esenale, trans-2-esenale, trans-2-esenolo, cis-3-esenolo, cis-3-esenilacetato e trans-2-esenilacetato

99 Origine delle sostanze aromatiche

100 Determinazione delle sostanze aromatiche La caratterizzazione delle sostanze aromatiche nellolio di oliva è effettuata ovviamente mediante la tecnica GC-MS Particolarmente utile è la tecnica di pretrattamento SPME, con la quale sono estratti selettivamente le sostanze volatili da iniettare nel cromatografo Esempio di cromagramma: le sostanze separate sono numerosissime

101 Variazione nel profilo aromatico Il profilo aromatico dellolio di oliva è influenzato da fattori come la cultivar e il grado di maturazione delle olive impiegate, il clima, la qualità del suolo e il processo di estrazione

102 Differenziazione di olio di origine diversa Attraverso la determinazione delle sostanze aromatiche e il trattamento statistico dei dati ottenuti è possibile distinguere olio di differente origine geografica

103 Sostanze coloranti La composizione chimica dellolio di oliva varia a seconda delle varietà delle olive, del loro grado di maturazione, delle condizioni ambientali, della provenienza geografica e delle tecniche di trattamento e conservazione. Tutti questi parametri influenzano anche il colore dellolio, una delle caratteristiche di base degli oli di qualità Il colore verde-giallastro dellolio è dovuto principalmente a tre gruppi di coloranti: clorofille, feofitine e carotenoidi

104 Una distribuzione tipica dei coloranti può essere la seguente: ColoranteGruppo% Range (mg/Kg) Clorofilla a Clorofille1 0.00 - 6.18 Clorofilla b Clorofille4 0.00 - 5.19 Feofitina a Feofitine48 2.06 - 37.06 Feofitina b Feofitine4 0.05 - 9.72 NeoxantinaCarotenoidi4 0.12 - 2.36 ViolaxantinaCarotenoidi4 0.00 - 5.15 LuteinaCarotenoidi35 3.96 - 14.78

105 Il ruolo dei coloranti Oltre a impartire il colore, queste sostanze hanno anche un ruolo attivo nella conservazione del prodotto: le clorofille e le feofitine, in sinergia con ioni metallici eventualmente presenti e in presenza di luce, possono agire come proossidanti favorendo la formazione di ossigeno singoletto, una specie chimica estremamente reattiva che può iniziare il processo di autoossidazione i carotenoidi, invece, sembrano avere un ruolo nel ritardare il processo di fotodecomposizione Clf 1 Clf* 3 Clf 1 O 2 (ossigeno singoletto) + O 2 luce Clf 1 Clf* 3 Clf 1 O 2 (ossigeno singoletto) + O 2 luceCarotenoidi Calore

106 Determinazione dei coloranti Lo spettro UV-visibile dellolio di oliva è fortemente caratterizzato dalle bande di assorbimento dei carotenoidi e delle clorofille: per questo motivo lanalisi dei coloranti è effettuata classicamente per via spettrofotometrica. I parametri determinati in questo modo sono relativi ai gruppi di coloranti (ovvero carotenoidi totali, clorofille totali, ecc.) e non ai singoli coloranti

107 Coloranti con HPLC Unanalisi più approfondita si può avere mediante estrazione SPE dei coloranti e separazione HPLC con rivelazione spettrofotometrica (430 nm, idonea per i carotenoidi) o spettrofluorimetrica (eccitazione a 440 nm ed emissione a 660 nm, idonea per clorofille e feofitine): in questo modo è possibile avere informazioni sui singoli composti, oltre a poter riconoscere trattamenti illeciti, come la deodorizzazione, un processo impiegato nel commercio di oli miscelati

108 Variazioni nel contenuto di coloranti Il contenuto di coloranti varia significativamente con il grado di maturazione delle olive: La varietà di olive variety lead to significant difference on the pigment composition of the end product; instead geographical origin affects mainly pigment amounts; (iii) the level of maturation of the fruits is closely correlated with the pigment amount: the collection of cherry olives for all the varieties guarantees a more elevated content in these substances than the productions obtained in complete or late maturation

109 Varietà di olive Siccome la quantità e il tipo di coloranti è variabile a seconda della varietà di olive, attraverso lanalisi dei coloranti e il trattamento statistico dei dati (analisi PCA) è possibile riconoscere le varietà di olive impiegate nella produzione di olio

110 Sostanze indesiderate Nella produzione di olio di oliva intervengono alcuni passaggi che possono dare al prodotto finale un apporto di sostanze indesiderate, per molte delle quali esistono limiti di legge Le riconosciute virtù nutrizionali dellolio di oliva hanno incrementato nel tempo la domanda dei consumatori. Ciò ha portato ad unevoluzione nella produzione di olio da unattività tradizionale basata su metodi biologici/macrobiotici ad unattività più moderna, ma non necessariamente più pulita, basata sullutilizzo di fertilizzanti e di altre sostanze nellambito di una produzione industriale. Queste sostanze possono lasciare residui che permangono fino al prodotto finale Tra le sostanze indesiderate nellolio di oliva un ruolo di spicco hanno i pesticidi, impiegati nei trattamenti di fertilizzazione, e i solventi, spesso impiegati fraudolentemente per il trattamento delle olive. Le normative vigenti sono molto restrittive sulla presenza di queste sostanze nellolio, che devono risultare assenti Attualmente cè una forte esigenza di prodotti a produzione biologica, in cui lutilizzo di sostanze potenzialmente contaminanti non è previsto

111 Pesticidi nellolio di oliva La determinazione dei pesticidi nellolio è complessa, in quanto esistono diverse famiglie di composti (organofosforo, organocloro, ecc.) e non è semplice riuscire ad isolarli tutti dalla matrice organica dellolio. Per la separazione si può impiegare la tecnica GC oppure la tecnica LC

112 Analisi di pesticidi con LC-MS Analisi LC-MS di un estratto da olio di oliva addizionato di pesticidi: è possibile determinare un gran numero di composti diversi

113 Sostanze aromatiche indesiderate Il principale processo di alterazione degli oli vegetali è costituito dallautoossidazione dei grassi insaturi che può modificarne le caratteristiche organolettiche, attraverso la formazione di composti odorosi, e le virtù nutrizionali attraverso reazioni secondarie In confronto con altri oli vegetali, lolio di oliva vergine mostra più resistenza allossidazione per via del basso tenore di acidi grassi poliinsaturi e della presenza di antiossidanti naturali come polifenoli e tocoferoli. Tuttavia, i processi di irrancidimento sono comunque possibili e tendono quantomeno a diminuire il contenuto di antiossidanti Lidentificazione di un processo di irrancidimento è perciò utile ed è possibile evidenziarlo attraverso il riconoscimento di sostanze marcatori, che nellolio di oliva risultano essere in particolare il nonanale, lottano, il 2-pentilfurano e il 2- etilfurano, sostanze che possono anche non essere attive dal punto di vista aromatico ma sono comunque indice di un processo di alterazione in corso nonanale 2-pentilfurano nonanale 2-pentilfurano

114 Analisi SPME Attraverso lanalisi GC-MS con pretrattamento SPME è possibile evidenziare la presenza di marcatori di irrancidimento 1B: olio di buona qualità 2B: olio ossidato; notare la presenza di nonanale (picco 1) e di 2- pentilfurano (picco 5)

115 Analisi FT-IR Lanalisi FT-IR di un olio di oliva, per quanto meno comune di quella UV-visibile, può fornire informazioni informazioni importanti sulla qualità del prodotto

116 Specie inorganiche Dal punto di vista chimico lolio doliva è una matrice di natura quasi completamente organica. Le eventuali sostanze inorganiche presenti hanno concentrazioni molto basse e non hanno alcuna rilevanza dal punto di vista organolettico e nutrizionale. Il concetto di residuo secco o di ceneri, familiare nellanalisi di alimenti liquidi come acqua, latte o vino, nel caso dellolio non è contemplato

117 I metalli nellolio I metalli sono generalmente presenti a bassissimi livelli nellolio di oliva: è ovvio che una matrice totalmente organica come lolio di oliva non costituisce un ambiente ideale per la solubilizzazione di ioni metallici. Il loro contenuto nelle olive è basso e la loro origine è più che altro da collegarsi al terreno, a residui di fertilizzanti oppure ai processi produttivi; nellolio si trovano sotto forma di complessi con molecole come i polifenoli o altri leganti naturali, oppure in sospensione La loro presenza non ha quindi significato dal punto di vista nutritivo ma alcuni di essi (in particolare Cu, Fe, Ni e Mn) possono influenzare negativamente la stabilità ossidativa dellolio catalizzando la decomposizione di idroperossidi e portando così alla formazione di composti indesiderati

118 Determinazione di metalli con GF-AAS La tecnica più idonea alla determinazione dei metalli nellolio di oliva è la spettrofotometria di assorbimento atomico con fornetto di grafite. Questa tecnica permette un controllo accurato sulla degradazione della matrice, parametro fondamentale nellanalisi di un alimento ricco di sostanze organiche come lolio

119 Nellanalisi GF-AAS dellolio unaliquota di campione (bastano 20 µl) è diluita con un solvente opportuno, come metil isobutil chetone o 1,4-diossano, e introdotta nel fornetto di grafite, dx, allinterno del quale è poi sottoposta ad un ciclo di Dettagli tecnici riscaldamento che ha lo scopo di separare la matrice organica dal metallo che si vuole dosare; il metallo è vaporizzato e genera un segnale analitico correlato alla concentrazione