DNA struttura e replicazione Cromosomi

Presentazione sul tema: "DNA struttura e replicazione Cromosomi"— Transcript della presentazione:

1 DNA struttura e replicazione Cromosomi

2 - Qual è la molecola responsabile dell’informazione biologica?
Nei primi decenni del ‘900 si raccolgono evidenze che i cromosomi sono costituiti da DNA e proteine. - Qual è la molecola responsabile dell’informazione biologica? - Qual è la sua struttura? Esperimenti di importanza fondamentale (Griffith, Avery et al., Hershey et al.) vengono effettuati negli anni ’30-50 su organismi semplici, quali batteri e batteriofagi e dimostrano che il materiale genetico è il DNA Aver capito la sua struttura ha permesso di capire come avviene la sua replicazione

3 1950 E. Chargaff scopre che nel DNA di specie diverse
c’è proporzionalità nella composizione in basi azotate: organismo A% T% G% C% Pneumococco 29.8 31.6 20.5 18.0 lievito 31.3 32.9 18.7 17.1 Riccio di mare 32.8 32.1 17.7 18.4 E.coli 26 24.9 24.8 25.2 uomo 30.9 29.4 19.9 19.8 ratto 28.6 28.4 21.4 21.5 La quantità totale delle purine (A+G) è uguale a quella delle pirimidine (T+C)

4 Cristallografia a raggi X (1952 R. Franklin)
M. Wilkins Diffrazione: deviazione della traiettoria delle onde quando queste incontrano un ostacolo L’ immagine di diffrazione ottenuta è compatibile con una struttura elicoidale

5 Nel 1953 James Watson e Francis Crick, basandosi sulle osservazioni di cristallografia ai raggi X di Rosalind Franklin e sull’osservazione di Erwin Chargaff, propongono il modello a doppia elica per la molecola di DNA

6 Il DNA è un polimero di nucleotidi
Nucleotide: molecola formata da uno zucchero pentoso (desossiribosio), un gruppo fosfato e una base azotata (A, C, G, T) A G T C 5’ 1’ 4’ 3’ 2’ purine pirimidine 5’ Adenina, citosina, guanina, timina 3’

7 Modello a doppia elica del DNA
Il DNA ha una struttura ad elica (in accordo coi dati di cristallografia) a doppio filamento Gli scheletri zucchero-fosfato sono posizionati esternamente, mentre le basi sono dirette verso l’interno e si appaiano (tramite legami idrogeno) alle basi “complementari” del filamento opposto in accordo con quanto osservato da Chargaff (in tutti i DNA % A = % T; % C = % G). L’appaiamento è sempre purina-pirimidina e questo mantiene il diametro dell’elica uniforme I due filamenti sono antiparalleli

8 Il diametro si mantiene costante perché le purine si appaiano alle pirimidine
2nm G ≡ C: 3 legami H A = T: 2 legami H

9 Il modello prefigurava genialmente una modalità di replicazione semiconservativa che verrà poi sperimentalmente dimostrata da Meselson e Stahl nel 1958 Ogni filamento dell’elica funziona da stampo per la sintesi di un nuovo filamento, sfruttando la complementarietà delle basi

10 Modelli di replicazione del DNA
Filamento parentale Filamento nuovo Oppure….. Alla fine del processo di sintesi potremmo ottenere: due molecole di DNA ciascuna costituita a un filamento di nuova sintesi e da un filamento originario (semiconservativa) una molecola di DNA costituita da due filamenti parentali e l’altra da due filamenti di nuova sintesi (conservativa) due molecole di DNA costituite entrambe da un’alternanza di filamenti nuovi e parentali (dispersiva)

11 La replicazione del DNA è semiconservativa:
ciascuno dei due filamenti parentali serve da stampo per la sintesi di un nuovo filamento e le due nuove doppie eliche sono costituite da ognuna da un filamento vecchio e da un filamento nuovo

12 DNA polimerasi

13 nucleotide (nucleoside trifosfato):
elemento costitutivo (monomero) degli acidi nucleici Evidenziare C 5’ e C 3’

14 La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato (nucleotide) all’estremità 3’OH 5’ 5’ 3’ 3’

15 La DNA polimerasi allunga il filamento nascente aggiungendo un nucleoside trifosfato all’estremità 3’OH

16 Entrambi i filamenti servono da stampo per la sintesi di nuovi filamenti, quindi la sintesi procede sui due filamenti stampo in direzione opposta 3’ 5’ 3’ Direzione di sintesi 5’ 5’ 3’ 3’ 5’

17 Replicazione del DNA

18 Replicazione del DNA 1 In corrispondenza delle origini di replicazione l’elicasi svolge i filamenti parentali della doppia elica rompendo i legami H tra le basi e generando due filamenti singoli Le ssbp (single strand binding proteins) legano il singolo filamento e lo stabilizzano Origin of replication Denaturazione del DNA helicase Questo schema (con questi enzimi) vale per i procarioti

19 Replicazione del DNA 2 innesco
La primasi (RNA polimerasi-DNA dipendente) sintetizza un breve innesco (primer) a RNA (le DNA pol non sono in grado di iniziare ex novo la sintesi, ma solo di allungare un 3’ preesistente) La DNA polimerasi III estende l’innesco a RNA sintetizzando DNA innesco 3’ helicase helicase

20 Ma cosa succede sul filamento complementare?
La DNA polimerasi procede, sul filamento leading, nella stessa direzione di avanzamento della elicasi e quindi in maniera continua … Ma cosa succede sul filamento complementare? Leading strand helicase

21 Il filamento ritardato (lagging strand) viene sintetizzato in maniera discontinua, attraverso la sintesi di una serie di frammenti (fr. di Okazaki) 5’ 3’ 5’ helicase primase

22 Replicazione del DNA 3 Rimozione del primer a RNA e “gap filling” da parte della DNA pol I Saldatura dei frammenti (ligasi) DNApolI ha attività RNasica? Si nei procarioti ( Negli eucarioti c’è RNase H 5’ helicase 5’ helicase ligase

23 La direzione di sintesi della DNA pol
La direzione di sintesi della DNA pol. è sempre 5’3’ uno dei due nuovi filamenti è sintetizzato in maniera discontinua, i frammenti vengono poi saldati

24 La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi
La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi. Complessivamente l’enzima ha una struttura dimerica, che contiene due copie di ciascuna subunità e due siti catalitici La DNA polimerasi III agisce come un dimero a livello della forca replicativa

25 La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi
La DNA polimerasi III è costituita da 10 diversi polipeptidi. Complessivamente l’enzima ha una struttura dimerica, che contiene due copie di ciascuna subunità e due siti catalitici La DNA polimerase III agisce come un dimero a livello della forca replicativa

26 La separazione dei filamenti di una struttura elicoidale genera dei superavvolgimenti
topoisomerasi Le Topoisomerasi hanno il compito di rilassare (eliminare) le tensioni che si creano nella doppia elica del DNA in seguito ai processi cellulari che implichino un cambiamento di topologia del DNA (trascrizione, replicazione del DNA)

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28 Caratteristiche delle DNA polimerasi
Necessità di innesco (causa: geometria del sito attivo, effetto: accuratezza) Attività esonucleasica 3’-5’ correzione di bozze (effetto: direzione di sintesi SOLO 5’-3’)

29 Replicazione del DNA circolare
ORI è sequenza ricca in A-T Nei procarioti l’origine di replicazione è singola Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI Origins tend to be "AT-rich" (rich in adenine and thymine bases) to assist this process, because A-T base pairs have two hydrogen bonds (rather than the three formed in a C-G pair)—in general, strands rich in these nucleotides are easier to separate because a greater number of hydrogen bonds requires more energy to break them

30 Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno
origini di replicazioni multiple Direzione di replicazione bidirezionale a partire da ORI multiple DNA pol delta e epsilon (l’analogo di DNA pol III negli eucarioti)

31 Le lunghe molecole di DNA lineare dei cromosomi eucarioti hanno
origini di replicazioni multiple Le DNA polimerasi eucariotiche hanno una velocità di incorporazione di 75 nucleotidi al secondo La lunghezza media di un cromosoma umano è 1.4 x 108 bp (3.2 x 109 bp genoma aploide/ 23 cromosomi) Se ci fosse una singola ORI, per duplicare un singolo cromosoma medio occorrerebbero più di 10 giorni In realtà la fase S dura circa 8 ore 10 giorni considerando un ORI interno al cromosoma, da cui si dipartono due forche replicative

32 Il cromosoma batterico ha un’unica ORI
Il genoma di E. coli è lungo 4.6x10 6 bp La velocità dellla Pol III arriva fino a 1000 nt/ sec Per replicare il cromosoma occorrono: 4.6x10 6 bp = 70 min c.a 1000nt/sec su ogni lato della forca replicativa quindi 35 min c.a

33 Alla DNA polimerasi è associata un’attività esonucleasica che
consente la “correzione di bozze”= rimozione di nucleotidi errati (tasso di errore durante la sintesi 1x10-4 nt; dopo correzione 1x10-10 nt). Con questo sistema vengono corretti gli errori di appaiamento commessi dalla DNA pol mentre la replicazione è in corso

34 Nel genoma umano (aploide) ci sono c.a. 3 x109 nt
di questi solo 6 x 107 nt (il 2%) sono sequenze codificanti (esoniche) Se non ci fosse correzione di bozze (tasso di errore durante la sintesi 1x10-4 nt): 6000 mutazioni cadrebbero in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA Dopo correzione di bozze (1x10-10 nt ): 0.006 mutazioni cadono in sequenze codificanti a ogni replicazione del DNA (1 mutazione ogni 166 replicazioni) Sono comunque maggiori di quelle osservate in una cellula, perché intervengono dei processi di riparazione del DNA

35 RIPARAZIONE DEI DISAPPAIAMENTI (mismatch repair)
provvede ad effettuare una scansione del DNA dopo la replicazione alla ricerca di appaiamenti errati Il sistema di riparazione è in grado di riconoscere e riparare il filamento di nuova sintesi Mismatch repair is strand-specific. During DNA synthesis only the newly synthesised (daughter) strand will include errors, and replacing a base in the parental strand would actually introduce an error. The mismatch repair machinery has a number of cues which distinguish the newly synthesised strand from the template (parental). In gram-negative bacteria transient hemimethylation distinguishes the strands (the parental is methylated and daughter is not). In other prokaryotes and eukaryotes the exact mechanism is not clear. Mismatch repair (MMR), which corrects errors of DNA replication and recombination that result in mispaired (but undamaged) nucleotides.

36 Un errore non corretto viene poi perpetuato nei cicli di replicazione
successivi

37 Difetti nel “mismatch repair”
Mutazioni nei geni che codificano per gli enzimi coinvolti nel mismatch repair sono associate al cancro. La cellula non riesce a riparare le mutazioni che si accumulano in tutto il genoma e che, quando colpiscono geni che regolano la proliferazione cellulare, inducono la trasformazione cancerosa (es: cancro del colon non poliposico ereditario HNPCC, autosomica dominante)

38 Cromosomi

39 Cromatina All’interno del nucleo della cellula eucariotica si trova la cromatina (DNA genomico + proteine) La cromatina appare organizzata in entità separate (cromosomi) quando la cellula è in mitosi interfase tarda profase inizio anafase

40 braccio p centromero = telomeri braccio q
P petit, q è semplicemente la lettera che segue la p According to the NCBI, "q" refers to the French word "queue" meaning 'tail' braccio q Ciascun cromosoma prima della mitosi è costituito da due cromatidi fratelli, tenuti insieme dal centromero

41 Telomeri Sequenze ripetute all’estremità dei cromosomi
costituiti da alcune migliaia di ripetizioni di sequenze brevi nell’uomo: (TTAGGG)n Proteggono il cromosoma dalla degradazione ad opera di nucleasi ed impediscono che le estremità dei cromosomi si saldino tra di loro

42 Telomeri Nelle cellule germinali e nelle cellule staminali la lunghezza dei telomeri rimane costante ad ogni divisione cellulare grazie all’attività della telomerasi Nelle cellule somatiche differenziate ad ogni replicazione del DNA il telomero subisce un accorciamento La riduzione dei telomeri dopo n divisioni provoca arresto della crescita cellulare e apoptosi

43 Replicazione dell’estremità del cromosoma

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45 Centromero È la regione del cromosoma in cui i cromatidi fratelli sono uniti Sequenza ripetute, eterocromatina In corrispondenza del centromero ci sono due cinetocori (uno per cromatidio) che servono ad agganciare il cromosoma alle fibre del fuso

46 Lunghezza del DNA genomico
Distanza tra due coppie di basi 0.34nm 3x109 bp (numero di basi di un genoma aploide umano) x 0.34nm (distanza tra due coppie di basi) = 1 metro (lunghezza di un genoma umano aploide) Deve essere compattato in un nucleo di pochi m!!!

47 Nucleosoma L’unità fondamentale della cromatina è il nucleosoma: tratto di DNA (146bp) avvolto con c.a. due giri attorno a un core formato da un ottamero istonico Istoni: proteine cariche positivamente (arg, lys) che interagiscono coi gruppi fosfato del DNA Linker c.a. 60 bp 11 nm

48 Ottamero istoni: 2 molecole di H2A, H2B, H3 e H4
11 nm (1.65 giri, 146 pb) H3 H2A H4 Dimensioni istone: 6 x 11 nm DNA linker + DNA avvolto sull’ottamero = 200bp c.a. 0.34 nm x 200bp = 70nm quindi il livello di compattamento nella fibra da 10nm è di 7X Nella fibra da 30nm ci sono 6 nucleosomi, quindi l’impaccamento è di 40X Le anse sono lunghe nt Ottamero istoni: 2 molecole di H2A, H2B, H3 e H4

49 Istone H1 e fibra da 30nm L’istone H1 (di giunzione) ha la funzione di compattare ulteriormente i nucleosomi Promuove la formazione della fibra solenoide da 30nm H1

50 Il cromosoma metafasico presenta un alto grado di compattazione della cromatina
Le anse sono lunghe nt

51 Livelli di compattamento
DNA avvolto attorno all’ottamero + DNA linker = 200bp c.a. 200bp x 0.34 nm = 70nm Il compattamento nella fibra da 11nm è di c.a. 7X

52 Livelli di compattamento
L’istone H1 lega il DNA linker e forma la fibra solenoide da 30nm Nella fibra da 30nm ci sono 6 nucleosomi, quindi l’impaccamento è di 40X Le anse sono lunghe nt

53 Eucromatina-eterocromatina
Eterocromatina è più compatta e trascrizionalmente inattiva Eucromatina interfasica trascrizionalmente attiva; si trova allo stato di cromatina distesa ed è accessibile agli enzimi della trascrizione

54 Eucromatina-eterocromatina
a eucromatina: frazione nucleare trascrizionalmente attiva e a bassa densità a b eterocromatina: frazione trascrizionalmente inattiva ed elettrondensa b sezione al microscopio elettronico

55 Nelle femmine di mammifero uno dei due cromosomi X è inattivato
Il cromosoma X inattivo è visibile nel nucleo interfasico di cellule ♀ come una masserella di cromatina condensata, addossata alla membrana nucleare Viene chiamata cromatina sessuale o corpo di Barr Nuclei di cellule della mucosa orale di ♀ (sinistra) e ♂ (destra)

56 Cariotipo Il cariotipo di una cellula eucariota è dato dal numero e dalla morfologia (posizione del centromero e dimensioni) dei suoi cromosomi metafasici

57 Il cariotipo umano Nel 1955 Tjio e Levan (analizzando centinaia di metafasi in 5 tessuti provenienti da 7 individui) dimostrano che il numero esatto di cromosomi umani è 46

58 Cromosomi umani #1→ 22 sono uguali nel maschio e nella femmina (autosomi) La 23esima coppia è quella dei cromosomi sessuali: XX nella femmina (sesso omogametico) XY nel maschio (sesso eterogametico) Negli uccelli il sesso omogametico è quello maschile (ZZ), mentre quello femminile è eterogametico (ZW)

59 Denaturazione e rinaturazione del DNA

60 Rinaturazione in presenza di una sonda
La sonda è una sequenza di DNA complementare a una determinata sequenza di interesse, che viene marcata con radioattivo o con fluorocromi

61 Ibridazione del cromosoma con sonde fluorescenti
Fluorescenza: emissione luce dopo irraggiamento con UV o anche luce visibile Cromosomi metafasici su vetrino; Denaturazione del DNA; Rinaturazione in presenza di un eccesso di sonda fluorescente specifica per una determinata regione del cromosoma

62 Ibridazione del cromosoma con sonde fluorescenti

63 telomero …AATCCCAATCC sonda TTAGGG*

64 Fluorescent In Situ Hybridization

65 Origine evolutiva del cromosoma 2 umano

66 Origine evolutiva del cromosoma 2 umano: fusione di cr 12 e cr 13 di pan troglodites
Sequenze telomeriche Sequenze telomeriche