Trascrizione Processo mediante il quale l’informazione contenuta in una sequenza di DNA (gene) viene copiata in una sequenza complementare di RNA dall’enzima.

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1 Trascrizione nei procarioti e negli eucarioti Regolazione dell’espressione genica

2 Trascrizione Processo mediante il quale l’informazione contenuta in una sequenza di DNA (gene) viene copiata in una sequenza complementare di RNA dall’enzima RNA polimerasi

3 Solo una frazione del genoma viene trascritta e tradotta, quella
CODIFICANTE Trend evolutivo: con l’aumentare delle dimensioni del genoma, aumenta la frazione non codificante 4300 geni 6X Genomi compatti e non <25000 geni 700X dimensioni: 4, , Mb

4 Nei procarioti i singoli geni sono separati da brevi sequenze non codificanti
Gene 1 Gene 2 Gene 3 Negli eucarioti i singoli geni sono separati da lunghissime sequenze non codificanti Gene 1 Gene 2 Gene 3

5 DNA non codificante Più del 98% del genoma umano è composto da sequenze non codificanti 26% del genoma umano è rappresentato da regioni introniche e sequenze regolatrici 44% del genoma umano è rappresentato da DNA altamente ripetuto: elementi trasponibili (elementi in grado di copiarsi e poi di integrarsi in altre posizioni del genoma) Non coding RNA (regolazione della trascrizione genica, inattivazione cromosoma X) Alcuni tratti di junk DNA sono conservati (Mark Gerstein and Deyou Zheng 2006 Scientific American) Coding + introni c.a. 28% Trasposoni: parassiti cellulari < 5% RNA della cellula è mRNA 8% del genoma umano è di origine retrovirale (300Mb), l’1.5-2% è coding (48Mb): nel nostro genoma abbiamo 6 volte più sequenze di origine virale rispetto a quelle codificanti. Sincizina è proteina di origine retrovirale che serve a fare sincizi e ha permesso ai mammiferi placentati di produrre la placenta. Proteina di origine virale utilizzata da noi!!! 48Mb coding / geni = 2000bp lunghezza media di un gene; 600aa lunghezza media di una proteina

6 Esempio di non coding RNA: XIST e inattivazione del cromosoma X nelle femmine di mammifero
Due cromosomi X attivi (primi stadi di sviluppo embrionale) Trascrizione XIST asimmetrica XIST XIST diffonde e si lega solo al cromosoma X che l’ha prodotto, causandone la condensazione e inattivazione

7 Esempio di non coding RNA: XIST e inattivazione del cromosoma X

8 Esempio di non coding RNA: XIST e inattivazione del cromosoma X

9 DNA non codificante Più del 98% del genoma umano è composto da sequenze non codificanti 26% del genoma umano è rappresentato da regioni introniche e sequenze regolatrici 44% del genoma umano è rappresentato da DNA altamente ripetuto: elementi trasponibili (elementi in grado di copiarsi e poi di integrarsi in altre posizioni del genoma) Non coding RNA (regolazione della trascrizione genica, inattivazione cromosoma X) MARs (Matrix attachment regions) condensazione della cromatina Pseudogeni (c.a sequenze simili a geni ma non più funzionanti) …. Alcuni tratti di junk DNA sono conservati (Mark Gerstein and Deyou Zheng 2006 Scientific American) Coding + introni c.a. 28% Trasposoni: parassiti cellulari < 5% RNA della cellula è mRNA 8% del genoma umano è di origine retrovirale (300Mb), l’1.5-2% è coding (48Mb): nel nostro genoma abbiamo 6 volte più sequenze di origine virale rispetto a quelle codificanti. Sincizina è proteina di origine retrovirale che serve a fare sincizi e ha permesso ai mammiferi placentati di produrre la placenta. Proteina di origine virale utilizzata da noi!!! 48Mb coding / geni = 2000bp lunghezza media di un gene; 600aa lunghezza media di una proteina

10 Origine pseudogeni. Esempio: geni globinici
Duplicazione 500 milioni anni fa Divergenza per accumulo mutazioni trasposizione Duplicazioni + mutazioni duplicazione genica + divergenza evolutiva = acquisizione di nuove funzioni / inattivazione del gene (ψ)

11 Trascrizione gene Filamento stampo (coding strand)
Complementarietà, un solo strand coding, Uracile

12 Geni posti sullo stesso cromosoma possono avere come “coding strand” filamenti diversi del DNA

13 Visione d’insieme della trascrizione

14 Inizio della trascrizione
la RNA polimerasi si lega al DNA in corrispondenza del promotore e “copia” il filamento di DNA stampo a partire dal sito di inizio della trascrizione

15 Alfa amanitina inibisce le RNA pol eucariotiche
Polipeptide biciclico L'avvelenamento con le amanitine è caratterizzato da un lungo periodo di latenza (dalle 6 alle 48 ore, in media 6-15 ore) durante il quale il paziente non accusa alcun sintomo.

16 Il promotore è una sequenza specifica del DNA che viene riconosciuta dalla RNA polimerasi e determina DOVE la sintesi del mRNA inizia e QUALE filamento del DNA debba essere utilizzato come stampo. Sito di inizio della denaturazione Promotore procariotico

17 Allungamento della catena dell’RNA
I due filamenti di DNA si svolgono e il DNA può essere copiato. La RNA polimerasi, a differenza della DNA polimerasi, non ha bisogno di un innesco Procarioti: RNA polimerasi si lega direttamente al promotore Eucarioti: fattori di trascrizione legano il promotore prima dell’ RNA polimerasi II

18 Allungamento della catena dell’RNA
A differenza delle DNA polimerasi, le RNA polimerasi non hanno attività “proof reading”

19 Allungamento della catena dell’RNA
3’

20 Terminazione Sequenze specifiche sul DNA (terminator) determinano l’arresto della trascrizione in corrispondenza di un determinato nucleotide (STOP site)

21 * Nei PROCARIOTI esiste una sola RNA polimerasi che trascrive i vari tipi di RNA:
rRNA  RNA ribosomale mRNA proteine tRNA  RNA di trasferimento ** Negli EUCARIOTI esistono tre RNA polimerasi distinte: RNA polimerasi I  rRNA RNA polimerasi II mRNA RNA polimerasi III  tRNA ma questa non è la sola differenza….

22 Nei procarioti il trascritto viene subito tradotto in proteina …

23 … nel nucleo delle cellule eucariotiche invece avviene un complicato processo di MATURAZIONE prima che il trascritto venga esportato nel citoplasma e tradotto.

24 Dal nucleo al citoplasma
pori nucleari linfocita visto al M.E. dopo criofrattura Dal nucleo dove avviene la trascrizione, gli RNA messaggeri maturi passano attraverso i pori nucleari nel citoplasma, dove vengono tradotti

25 Nei geni degli eucarioti le
sequenze codificanti per proteine (esoni) sono interrotte da sequenze non codificanti (introni). Il trascritto primario, prima di abbandonare il nucleo, viene sottoposto ad un processo di taglio e ricucitura (splicing): gli introni vengono eliminati e gli esoni riuniti uno all’altro. La molecola di mRNA maturo che esce dal nucleo sarà costituita da una sequenza codificante continua

26 Splicing alternativo http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21311748
Splicing alternativo e deacetilazione degli istoni

27 Splicing alternativo Il fenomeno dello SPLICING alternativo negli eucarioti aumenta il potenziale espressivo del genoma. E’ la regola, non l’eccezione Mediante forme di splicing alternativo da uno stesso gene possono derivare trascritti diversi che, una volta tradotti, danno luogo a proteine diverse

28 Potenziale espressivo in H. sapiens
In H. sapiens si stima che la percentuale di geni che subiscono splicing alternativo sia >90% (Hallegger M et al., 2010) N° geni H. sapiens : geni subiscono AS Il numero medio di varianti di splicing prodotto da ciascuno di questi geni è 4 (Kim H et al., 2004) La stima del numero di proteine prodotte è di Per sapere quante proteine si originano bisognerebbe conoscere il numero medio di varianti di splicing per questi geni, che originano isoforme proteiche (un gene che subisce AS può produrre molte forme alternative di mRNA e non tutti i mRNA vengono tradotti in proteine, alcuni subiscono NMRD) ??? Kim H 2004 da una stima per h. sapiens di 4 forme di splicing alternativo in media per gene (

29 Splicing alternativo dell’ mRNA per la tropomiosina
(5 isoforme) Per TPM1 TroPoMyosin 1 in genecards sono riportate attualmente (ott 2008) 7 varianti di splicing (2 isoforme nei fibroblasti) Tropomiosina: proteina che lega l’actina (coinvolta nella contrazione muscolare) e fa parte delle proteine del citoscheletro nelle cellule non muscolari

30 Altre differenze fra procarioti ed eucarioti…..
Nei procarioti più geni possono essere trascritti in un unico mRNA (RNA policistronico) Negli eucarioti sempre 1 mRNA = 1 gene Negli eucarioti 1mRNA 1 polipeptide a meno di splicing alternativo 5’ Cap (7 metil guanilato) e poli A stabilizzano mRNA e costituiscono segnale d’attacco ai ribosomi. Poli A coinvolto in esportazione dal nucleo Stabilizzazione mRNA Esportazione mRNA dal nucleo Stabilizzazione mRNA Legame al ribosoma

31 mRNA eucariotico trascrizione + splicing traduzione
UnTranslated Region

32 Regolazione dell’espressione genica
Solo alcuni geni vengono costituzionalmente trascritti (geni housekeeping: enzimi del metabolismo, RNA polimerasi, ribosomi, istoni…) Per tutti gli altri esistono molti meccanismi che permettono di regolare se, quando (meccanismi di regolazione temporali) e quanto un gene deve essere trascritto Ciò è particolarmente evidente e importante negli organismi eucarioti multicellulari dove esiste una regolazione tessuto specifica (cellule diverse producono proteine diverse) Anche nei procarioti tuttavia vi sono meccanismi di regolazione dell’espressione genica OPERONI

33 Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti
cardiomiocita epatociti neurone This is a single cardiomyocyte isolated from the heart of a normal mouse which has been labeled with antibodies to two different proteins which are normally present in myofibrils. The alternating bands of tropomodulin (green) and alpha-actinin (red) show the dense packing of myofibril throughout the interior of the cell Hanno tutti lo stesso DNA, ma esprimono geni differenti Il pattern di geni espressi per ogni tipo cellulare è diverso

34 Potenziali punti di controllo dell’espressione genica
In primo luogo la conformazione della cromatina condiziona la trascrizione (cromatina addensata = trascrizionalmente inattiva) EUCARIOTI

35 Potenziali punti di controllo dell’espressione genica
Controllo trascrizionale: esercitato da interruttori molecolari Fattori di trascrizione (proteine che si legano al DNA) nel sito promotore dei singoli geni o in corrispondenza di altre sequenze regolatrici

36 Recettore degli androgeni (AR)
Membrana cellulare Esempio di fattore di trascrizione Recettore Membrana nucleare trascrizione

37 Regolazione trascrizionale

38 Regolazione coordinata dell’espressione genica
Un unico fattore di regolazione dell’espressione può controllare diversi geni. Esempio: Recettore degli Androgeni, Recettore degli Estrogeni (ER) RXRA Retinoic Acid Receptor a OXT oxytocin CRH Corticotropin-Releasing Hormone ERE Estrogen Responsive Element 5’-GGTCAnnnTGACC-3’ Questa sequenza si trova nel promotore di tutti i geni controllati da ER

39 Regolazione coordinata dell’espressione genica nei procarioti: operoni
Operone lac Operone: insieme di geni codificanti per proteine coinvolte nello stessa via metabolica la cui espressione è regolata in modo coordinato. Oltre ai geni trascritti (in un unico RNA messaggero) contengono anche sequenze regolatrici (promotore, operatore) Operone: geni strutturali + seq regolatrici (operatore, promotore)

40 Potenziali punti di controllo dell’espressione genica
Splicing alternativo regolato da proteine cellula-specifiche Stabilità del mRNA (l’emivita del messaggero incide sulla quantità di proteina sintetizzata) Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze specifiche per la stabilità del messaggero Spesso in 3’ UTR ci sono sequenze specifiche per la stabilità del messaggero (vedi alfa e beta globine) Inizio della traduzione Può essere bloccata da proteine regolatrici

41 Esempio di regolazione temporale dell’espressione: i geni codificanti per le globine
Globina+eme Tetramero Quattro subunità

42 Le emoglobine umane 22 22 2 b2 (2 d2) Emoglobina embrionale
Emoglobina fetale Emoglobina adulta e Hb fetale> affinità per ossigeno di Hb adulta: a livello placentare il sangue materno cede ossigeno al sangue fetale Durante lo sviluppo differenti geni per la globina vengono espressi in tempi diversi

43 Famiglia dei geni a e b globinici: la stretta vicinanza e l’ordine di sequenza facilitano la coordinazione temporale della loro espressione durante lo sviluppo Geni identici I due geni alfa sono identici (vedi genecards). I due geni gamma differiscono per il residuo 136 (Gly o Ala). HbA2 (alfa2 delta2) costituisce il 3% dell’emoglobina adulta funzione? LCR Locus Control Region (enhancer) LCR Differiscono per aa 136 (Gly-Ala)

44 Geni globinici: un’unica regione di controllo -LCR- regola l’attivazione o l’inattivazione dei singoli geni