Tecniche per l’analisi degli alimenti

Presentazione sul tema: "Tecniche per l’analisi degli alimenti"— Transcript della presentazione:

1 Tecniche per l’analisi degli alimenti
Tecniche cromatografiche Tecniche spettroscopiche Tecniche elettrochimiche Tecniche volumetriche Saggi qualitativi

2 Tecniche cromatografiche
Sono utilizzate per separare e identificare singolarmente i componenti di una miscela Tswett (inizio del XX secolo) interessato a separare le sostanze coloranti della clorofilla

3 L’esperimento di Tswett
Tswett fece passare miscele di pigmenti colorati di origine vegetale attraverso una colonna di vetro riempita con carbonato di calcio. I pigmenti si separarono in singole bande colorate lungo la colonna

4 Una delle due fasi viene immobilizzata (fase stazionaria), mentre l’altra fase (fase mobile) viene fatta scorrere continuamente su quella stazionaria La miscela di analiti viene eluita nella fase mobile. La separazione nel tempo degli analiti dipende dalla diversa entità della loro interazione con la fase stazionaria.

5 CROMATOGRAFIA: meccanismi di separazione
di adsorbimento, FASE STAZIONARIA = SOLIDO di ripartizione, FASE STAZIONARIA = LIQUIDO a scambio ionico ad esclusione di affinità

6 Tecniche cromatografiche
In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare: su carta, su strato sottile (TLC) In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC) Cromatografia fluida supercritica (SFC) In base al meccanismo di separazione Adsorbimento Ripartizione Scambio ionico (IEC) Esclusione (SEC) Affinità

7 Tipi di cromatografia I due gruppi principali di tecniche cromatografiche sono: la cromatografia liquida, nella quale la fase mobile è liquida e la fase fissa è solida o liquida la gascromatografia, nella quale la fase mobile è gassosa e la fase fissa è solida o liquida

8 Schema delle tecniche

9 Principi della cromatografia
Sfrutta la differenza di interazione dei componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la fase fissa o stazionaria, e di un supporto dinamico, la fase mobile o eluente, che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze componenti la miscela.

10 Principi della cromatografia-2
Le sostanze che compongono la miscela vengono identificate mediante un rivelatore posto all’uscita dalla fase fissa che registra le modifiche di alcune proprietà chimico-fisiche. Il responso che si ottiene si chiama cromatogramma

11 Principi della cromatografia
Differenza di interazione dei componenti di una miscela nei confronti di un supporto statico, la fase stazionaria, e di un supporto dinamico, la fase mobile o eluente, che fluisce attraverso la fase fissa trascinando le sostanze componenti la miscela. Il componente X si distribuisce tra le due fasi: Il coefficiente di distribuzione del componente X è definito come:

12 IL CROMATOGRAMMA

13 Alcune considerazioni…
tR tM In condizioni ideali, il picco cromatografico è una curva gaussiana: Altezza del picco (h) Larghezza della base del picco (w) Distanza tra i punti di flesso (wi=2s)

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15 Analogamente si definiscono i corrispondenti:
tR tM Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna. Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna. Analogamente si definiscono i corrispondenti: Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita dall’inizio all’uscita della colonna. Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

16 Selettività di un processo cromatografico
Selettività: capacità di un sistema cromatografico di eluire specie chimiche diverse a velocità il più possibile diverse Fattore di separazione: a = t2 /t1 = K2 / K1  Selettività dipende dal meccanismo della separazione 16

17 Efficienza di un processo cromatografico
Efficienza: capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità, in modo da formare bande strette, che forniscono picchi stretti 17

18 La risoluzione dipende dalla separazione e dalla larghezza dei picchi

19 Come selettività ed efficienza influenzano la risoluzione

20 Caratteristiche di un processo cromatografico:
migrazione differenziale allargamento di banda

21 Migrazione differenziale
Differenza di velocità di migrazione Differenza di equilibri di distribuzione Variabili: Composizione fase stazionaria Composizione della fase mobile Temperatura

22 Allargamento di banda Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo Gaussiano. Il centro del profilo (banda di eluizione) rappresenta la velocità media. I fattori che provocano deviazioni dal valore medio sono: diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela all’asse della colonna); percorsi multipli;

23 Capacità di campione La capacità di campione della fase stazionaria è la quantità di campione che può essere assorbita in una fase stazionaria, prima che si verifichi un sovraccarico. Effetti del sovraccarico: Picchi asimmetrici Variazione dei tempi di ritenzione Perdita di risoluzione

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25 Cromatografia Liquida
Cromatografia su colonna : la fase stazionaria è contenuta in un sottile tubo; la fase mobile la attraversa per gravità o sotto pressione. Cromatografia planare : la fase stazionaria è supportata nei pori della carta o su una superfice piana; la fase mobile si muove, attraverso la fase stazionaria, per azione della capillarità (tecnica ascendente) o per gravità (tecnica discendente). 25

26 Cromatografia su Strato Sottile, TLC
La più semplice forma di cromatografia liquida è la cromatografia su strato sottile (TLC, Thin Layer Chromatography). E’ una cromatografia planare - ascendente È una tecnica estremamente semplice e veloce che consente l’analisi qualitativa e quantitativa dei componenti di una miscela e trova ampia applicazione come supporto ad un gran numero di metodologie di laboratorio.

27 Analisi quantitativa (lastre preparative)
TLC Analisi qualitativa Spessore della fase stazionaria minore ( mm) Analisi quantitativa (lastre preparative) Spessore della fase stazionaria maggiore (1-2 mm)

28 Cromatografia su Strato Sottile, TLC
La fase stazionaria è solida e tipicamente si tratta di un sottile strato di silice (SiO2) o allumina (Al2O3) adsorbito su un supporto inerte di plastica, di alluminio (lastrina) o meno comunemente di vetro. La fase mobile – detta anche eluente – è un liquido organico che si muove lungo la fase stazionaria per capillarità.

29 Cromatografia Liquida
Cromatografia su Strato Sottile, TLC

30 Il campione viene applicato alla lastra mediante una micropipetta o una siringa sotto forma di macchia, a circa 2,0 cm dal bordo.

31 La separazione avviene in un recipiente di vetro che contiene sul fondo circa 1,5 cm di solvente di sviluppo. Si posiziona verticalmente la lastra nel recipiente facendo in modo che peschi nel solvente, ma che il liquido non ricopra le sostanze depositate:

32 La fase mobile sale lungo la fase stazionaria per capillarità trascinando con se le sostanze. Lo sviluppo viene arrestato quando il fronte del solvente ha raggiunto circa i due terzi della lunghezza della lastrina: normalmente occorrono pochi minuti.

33 Cromatografia su strato sottile
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35 Punto di applicazione del campione
Fronte del solvente Sostanze separate 35

36 Una volta asciugato il solvente, le macchie di sostanza possono essere caratterizzate dal fattore di ritardo (Rf), che esprime l’affinità relativa della sostanza per il sistema fase mobile/fase stazionaria:

37 Interazioni dei composti con la fase stazionaria
La cromatografia su strato sottile è una cromatografia di adsorbimento, in cui la separazione viene determinata dalle differenti interazioni delle molecole con le particelle di fase stazionaria. La fase stazionaria è un solido polare La fase mobile è costituita da solventi organici a diversa polarità (cromatografia in fase diretta).

38 Gel di silice La fase stazionaria più comune
La fase stazionaria di silice è polare dal momento che in superficie il polimero di biossido di silicio espone sia dei legami Si-O polarizzati che dei gruppi funzionali Si-OH (silanoli):

39 Interazioni dei composti con il gel di silice
Quando la fase mobile sale lungo la silice, i composti in essa disciolti sono in grado di interagire con i gruppi polari della silice. Le interazioni in gioco sono principalmente dipolo-dipolo e formazione di legami ad idrogeno e dunque quanti più polari sono i composti, tanto più verranno trattenuti dalla fase stazionaria.

40 Interazioni dei composti con il gel di silice
Fase Mobile

41 Ordine di eluizione di composti organici sulla silice

42 Potere eluente dei più comuni solventi organici

43 Potere eluente dei più comuni solventi organici

44 TLC: Aspetti pratici DA NON FARE
Applicare le macchie troppo vicine tra loro Immergere l’origine nel solvente Marcare le macchie con una penna

45 TLC Aspetti pratici DA FARE:
Mantenere la camera satura Marcare dove si applicano le macchie Applicare le macchie compatte e non troppo vicino al bordo (sopra il livello della f.m.) Marcare il fronte del solvente

46 Rivelazione dei componenti
In alcuni casi di analiti colorati non è necessaria alcuna operazione. Spruzzando sulla lastra acido solforico al 50% o acido solforico al 25% in etanolo, si ottiene la carbonizzazione della maggior parte dei composti che, pertanto, saranno visibili come macchie marroni. 46

47 Rivelazione dei componenti
L'esame della lastra sotto luce ultravioletta mostrerà la posizione di sostanze che assorbono nell'ultravioletto o di composti fluorescenti. Molti adsorbenti commerciali usati per la cromatografia su strato sottile contengono un colorante fluorescente, così che, all'esame in luce ultravioletta, i composti separati appaiono come macchie blu, verdi o nere su uno sfondo fluorescente.

48 La silice delle lastrine per TLC F254 è imbevuta di Fluoresceina, una sostanza in grado di assorbire la luce ultravioletta a 254 nm e riemettere luce per fluorescenza.

49 Lampada UV Rivelazione di due composti Tre deposizioni a concentrazione differente. Una elevata concentrazione diminuisce l’efficienza della separazione

50 TLC: METODI DI RIVELAZIONE
LUCE UV sostanze che assorbono o fluorescenti VAPORI DI IODIO lipidi insaturi REATTIVI SPECIFICI (ninidrina per gli amminoacidi) ACIDO SOLFORICO sostanze organiche

51 Analisi quantitativa (lastre preparative)
TLC Analisi qualitativa Analisi quantitativa (lastre preparative) Spessore della fase stazionaria maggiore (1-2 mm)

52 Separazione PTLC idrocarburi squalene tocoferoli terpeni alcoli
steroli eritrodiolo + uvaolo linea di deposizione Separazione su strato sottile della frazione insaponificabile, effettuata con miscela benzene-acetone 95:5