SPECIFICITA’ E MECCANISMI DI REVISIONE.

Presentazione sul tema: "SPECIFICITA’ E MECCANISMI DI REVISIONE."— Transcript della presentazione:

1 SPECIFICITA’ E MECCANISMI DI REVISIONE

2 La specificità è la discriminazione di un enzima tra diversi
substrati in competizione per il sito attivo e soprattutto in competizione per la catalisi Esempio: una particolare aminoacil-tRNA sintetasi è specifica per un determinato aminoacido e per un determinato tRNA, ovvero riesce a sintetizzare con un errore molto piccolo un determinato aminoacil-tRNA, in un miscuglio di tutti gli aminoacidi e gli tRNA presenti nella cellula. Il problema della specificità enzimatica deve prendere in considerazione le velocità relative delle reazioni di tutti i substrati che competono tra loro. In questo senso la specificità dipende non solo dal legame, ma anche dalla velocità catalitica (KM e kcat), ovvero da kcat/KM).

3 I LIMITI DELLA SPECIFICITA’
Un enzima non ha problemi a discriminare tra il “suo” substrato ed uno più grande. Il problema è quello di limitare al massimo la catalisi della trasformazione di substrati isosterici o più piccoli. Il sito attivo dell’enzima può essersi evoluto al fine di escludere efficientemente determinati substrati “pericolosi”, ma solo se questi hanno caratteristiche molto diverse dal substrato naturale (cariche opposte o gruppi polarità/apolari). Inoltre, le reazioni dei substrati più piccoli comportano rapporti kcat/KM molto inferiori.

4 I sistemi in cui un’alta specificità è essenziale sono la replicazione
del DNA e la sintesi delle proteine. Questi processi, a causa della pressione evolutiva sugli enzimi che li catalizzano, indicano i limiti massimi possibili della specificità.

5 Buoni esempi di discriminazione si hanno con le
aminoacil-tRNA sintetasi Reagisce con una velocità 2•105 volte inferiore Legame 150 volte più debole Legame 200 volte più debole

6 La specificità può essere analizzata in base alla teoria dello
stato di transizione. Se il substrato isosterico o più piccolo differisce per un elemento che determina una differenza di energia di legame dello stato di transizione pari a Gb, allora la massima discriminazione possibile in base a questa differenza sarà l’esponente (- Gb/RT).

7 X

8 La specificità dei substrati in competizione dipende dal
legame relativo dei loro stati di transizione con l’enzima. La complementarietà enzima-stato di transizione massimizza la specificità perché assicura il legame ottimale dello stato di transizione desiderato. Questo è anche il criterio per il valore ottimale del rapporto kcat/KM. La specificità è infatti determinata proprio da questo rapporto.

9 MECCANISMI DI REVISIONE O CORREZIONE DELLE BOZZE
L’accuratezza della replicazione del DNA e della sintesi delle proteine è limitata, rispettivamente, dall’accopiamento delle basi azotate complementari e dall’energia di legame delle catene laterali degli aminoacidi alle proteine, ovvero la selezione dei diversi amminoacidi. L’appaiamento delle basi è accurato fino a circa una parte su 104 –105. Eppure la frequenza di errore nella replicazione è di L’accuratezza della selezione degli aminoacidi raggiunge soltanto circa una parte su 102. Eppure la frequenza di errore nella traduzione è di Questo è possibile per via dell’evoluzione di meccanismi di revisione.

10 Alcuni enzimi chiavi della polimerizzazione hanno sviluppato,
oltre al sito attivo per la sintesi, un secondo sito attivo idrolitico che è usato per distruggere intermedi o prodotti incorretti mano a mano che si formano. La sintesi è perciò controllata due volte. Il punto cruciale di un meccanismo di revisione è la formazione di un intermedio ad alta energia che è instabile e, nel caso in cui sia avvenuto un errore, permette l’idrolisi oppure procede nella sintesi. Questo permette un controllo cinetico dell’accuratezza.

11 REVISIONE NELLA SINTESI PROTEICA
La componente meno accurata della traduzione, che necessita un meccanismo di revisione, è la selezione degli aminoacidi nella formazione degli aminoacil-tRNA. Il fenomeno della revisione fu scoperto inizialmente in relazione alla isoleucil-tRNA sintetasi. Il gruppo metile in più nella isoleucina rispetto alla valina favorisce l’attivazione della prima di un fattore Ma siccome la valina nella cellula è concentrata 5 volte di più, la probabilità di errore aumenta ad uno su Eppure il tasso di errore trovato nella traduzione è solo di uno su 3000.

12 In presenza di valina e tRNAIle, la isoleucil-tRNA sintetasi
è una ATP pirofosfatasi che catalizza l’idrolisi di ATP e poi di valil-adenilato attraverso la reazione di attivazione. Ci sono due intermedi ad alta energia che potrebbero subire la correzione tramite idrolisi: l’aminoaciladenilato e l’aminoacil-tRNA.

13 La valil-tRNA sintetasi ha un sito di idrolisi distinto e separato dal sito
dove avviene l’acilazione (sintesi). Il valore di kcat/KM per l’acilazione del treoniladenilato è circa 600 volte Inferiore di quello per l’attivazione della valina. Il complesso Thr-tRNA Si forma, ma viene rapidamente idrolizzato con una costante di velocità di 40 s-1. Il complesso Val-tRNA viene idrolizzato 3000 volte più lentamente. Le differenze strutturali tra treonina e valina vengono perciò usate due volte.

14 Nella valil-tRNA sintetasi c’è un doppio meccanismo di controllo
e correzione, operato sia la livello dell’aminoaciladenilato che dell’aminoacil-tRNA.

15 Analogia tra il processo di selezione operato dalle aminoacil-tRNA
sintetasi e un meccanismo di selezione a “doppio setaccio”

16 REVISIONE NELLA REPLICAZIONE DEL DNA
Differenze fondamentali tra la sintesi delle proteine e la replicazione del DNA: nella sintesi delle proteine esiste una sintetasi per ogni aminoacil-tRNA. Nella replicazione del DNA c’è un’unica polimerasi per i quattro appaiamenti corretti. 2) nella sintesi delle proteine la correzione deve avvenire prima della formazione del legame peptidico. Nella replicazione del DNA la correzione può avvenire dopo la polimerizzazione.

17 Sintesi delle proteine
Replicazione del DNA

18 Le DNA polimerasi procariotiche hanno un’attività esonucleasica
in direzione 3’  5’. Questa attività è maggiore per basi non correttamente appaiate o singoli filamenti di DNA. La frequenza di mutazione nel batteriofago T4 è inversamente proporzionale alla attività esonucleasica della sua DNA polimerasi.

19 Meccanismo molecolare della correzione della DNA polimerasi
Nella DNA polimerasi di E. coli il sito di correzione si trova a 35 Å dal sito di polimerizzazione. I meccanismi di polimerizzazione e di idrolisi sono simili. Si basano entrambi sulla presenza di due ioni metallici che stabilizzano le cariche nascenti. Il DNA è in equilibrio di legame con entrambi i siti. Il sito di polimerizazione è normalmente maggiormente occupato (per quasi il 90%). In presenza di appaiamenti non corretti, le percentuali di occupazione si invertono.

20 Polimerizzazione

21 Idrolisi (attività esonucleasica)