Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot

Presentazione sul tema: "Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot"— Transcript della presentazione:

1 Analisi di proteine: Elettroforesi e Western Blot
Seminario Metodologico per il Corso di Biologia Molecolare II Michela A. Denti

2 Elettroforesi

3 Analisi elettroforetica delle proteine del siero

4 Elettroforesi su gel Metodo per separare le molecole (DNA, RNA, proteine, etc.) sulla base di proprieta’ fisiche o chimiche quali: (1) dimensioni (2) forma (3) carica elettrica

5 Elettroforesi su gel campione 1 campione 2 Controllo

6 Elettroforesi di DNA I gel sono fatti di agarosio o di poliacrilammide
I campioni di DNA vengono caricati ed e’ applicata una differenza di potenziale Il DNA, carico negativamente, migra verso l’elettrodo “+” I frammenti di DNA piu’ piccoli migrano piu’ velocemente

7 Elettroforesi di Proteine
Piu’ complessa dell’elettroforesi di DNA Proteine diverse hanno cariche diverse Le proteine variano molto per forma Generalmente il gel e’ fatto di poliacrilammide

8 Perche’ usare Gel di Poliacrilammide per separare le proteine?
I gel di poliacrilammide hanno una trama piu’ compatta I pori hanno dimensioni minori che nei gel di agarosio Le proteine sono molto piu’ piccole del DNA Amminoacido medio = 110 Da Paio di nucleotidi medio = 649 Da 1 kilobase di DNA = 650 kDa 1 kilobase di DNA codifica 333 amminoacidi = 36 kDa

9 Elettroforesi di proteine Condizioni Non Denaturanti
Non-denaturante (nativo): nessun pre-trattamento delle proteine prima dell’elettroforesi Le proteine conservano la loro forma normale (struttura 2° e 3°; legami disolfuro covalenti) Le proteine conservano la loro carica normale Le proteine sono separate sulla base di carica, dimensioni e forma Nome Carica Massa Forma Proteina Q Proteina R +3 30kD 4 42kD

10 Elettroforesi di proteine Condizioni denaturanti
Le proteine sono trattate con SDS (detergente anionico) prima dell’ elettroforesi (SDS-PAGE) Le molecole di SDS si legano alle proteine Le proteine perdono la loro normale forma Le proteine hanno tutte lo stesso rapporto carica/massa Le proteine vengono separate esclusivamente sulla base delle loro dimensioni Carica Massa kD 4 42kD Carica Massa  kD  kD SDS

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12 SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE)
CH2 CH3 SDS SDS (Sodio Dodecil Solfato) Solubilizza e denatura le proteine Aggiunge cariche negative alle proteine

13 Proteina Nativa Carica netta: -4 Proteina trattata con SDS Carica netta: Molto (-)

14 Come funziona un Gel SDS-PAGE ?
Le proteine cariche negativamente si muovono verso l’elettrodo positivo Proteine piu’ piccole si muovono piu’ velocemente Le proteine si separano per dimensione SDS, calore s-s Proteine con SDS + –

15 Campioni proteici Estratti di tessuti o cellule
Proteine ricombinanti “etichettate” con antigeni (“tags”: HA, T7) Virus interi purificati Localizzazione cellulare (nucleo, membrana, citoplasma) Expression of cloned gene and the analysis of the proteins it encodes, refer to agroinfiltration as carrier Cellular location—may help determine composition of lysis buffer Structural integrity, protease activity

16 Estrazione delle proteine
Lisi delle cellule con un tampone di lisi che dissocia le proteine e inibisce le proteasi cellulari Concentrazione dei sali Detergenti (Triton X-100, NP40, SDS) pH Inibitori di proteasi Bassa temperatura (ghiaccio) Proteasi Proteasi Inibitori proteasi: Leupeptina, Pepstatina, Aprotinina, PMSF

17 Cosa c’e’ nel tampone di caricamento?
Un tampone (Tris) per fornire il giusto pH (6,8) SDS (Sodio Dodecil Solfato) per solubilizzare le proteine e fornire loro una carica negativa complessiva Glicerolo per rendere pesanti i campioni e farli scendere nei pozzetti Un agente riducente (DTT o b-Mercaptoetanolo) per rompere i legami disolfuro Un colorante (Blu di Bromofenolo) per visualizzare i campioni

18 SDS-PAGE acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%
Colorazione con Blu di Coomassie acrilammide/bis-acrilammide 29:1 (6-20%)+ SDS 0.1%

19 Sistemi per la corsa di SDS-PAGE
Amersham Biosciences Bio-Rad Piccolo (8 x 10 cm) Medio (16 x 16 cm)

20 Il Gel Come funziona: Stacking gel: 4-5% gel superiore, pH 6.8
8-14% gel separatore, pH 8.8 Le molecole di acrilammide sono tenute assieme dalla bis-acrilammide, formando una struttura a lattice Polimerizzazione piu’ rapida aggiungendo catalizzatori: TEMED e APS Discontinuous buffer system The amount of acrylamide determines pore size—in turn affecting how fast the protein will move through the gel Low acrylamide (big pores)- large protein moves fast vs. high acrylamide (small pores)– slower movement Free radicals accelerate polymerization time, TEMED catalyzes the productions of free-radicals (highly reactive, charged, yielding chemical reaction) from APS, approx 30’ to 1hr., will happen w/o, but takes a long time. In chemistry, free radicals are uncharged atomic or molecular species with unpaired electrons or an otherwise open shell configuration. These unpaired electrons are highly reactive, so free radicals are likely to take part in chemical reactions. Free radicals play an important role in combustion, atmospheric chemistry, polymerization, plasma chemistry, biochemistry, and many other chemical processes.

21 Il Gel Componenti del gel SDS-PAGE
Soluzione di Acrilammide/Bis-Acrilammide Tris-HCl pH 6.8 oppure Tris-HCl pH 8.8 SDS ddH2O TEMED APS (ammonio persolfato) Buffer di corsa (Tris, Glicina, SDS) Pre-cast gels commercially available Acrylamide potent neurotoxin, absorbed through skin…polymerized gel considered nontoxic APS decomposes slowly, prepare fresh for best results

22 Il Gel Come funziona: Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8
Proteine vengono caricate, viene applicata una corrente elettrica Includere un marker di peso molecolare colorato 10-50ug di estratto proteico totale 0.1-1ug di proteina purificata Ioni Cloruro (-) / Proteina / Glicina (+) Si muovono verso il gel separartore (“resolving) Differenze di pH causano la ionizzazione della glicina, permettendo alle proteine di migrare nel gel separatore Il Gel – Stacking pH 6,8 Resolving pH 8,8 MW markers help with orientation when transferring to membranes, band sizes different depending on gel % and composition, see manufacturer details Proteins are sandwiched between chloride ions from Tris-HCl in the stacker and sample buffer and the glycine molecules from the running buffer forming a thin zone or stack, depositing proteins on the surface of the resolving gel +

23 Il Gel % di acrilammide consigliata 8% 10% 12%
Dimensioni delle proteine kDa kDa 10-40 kDa

24 Visualizzazione delle proteine nel gel
I due metodi piu’ usati sono: Colorazione con il Coomassie Brilliant Colorazione con l’argento “Silver staining” (puo’ essere visualizzato ~1ng di proteina per banda) Coomassie staining Silver staining

25 Stima dei pesi molecolari
kD mm 8 44.5 250 200 150 Dimensioni in kDa 100 50 20 40 60 Distanza (mm dal pozzetto)

26 Stima dei pesi molecolari

27 Western Blotting

28 Southern Blot: Per l’analisi del DNA.
(sonda = DNA o RNA). Northern Blot: Per l’analisi dell’ RNA. Western Blot: Per l’analisi delle proteine. (sonda = anticorpo).

29 Cosa e’ un Western Blot? Una tecnica in cui le proteine sono separate mediante elettroforesi su gel e successivamente trasferite su un supporto (membrana o filtro). Successivamente una specifica proteina viene identificata mediante la sua reazione specifica con un anticorpo.

30 A cosa serve il Western Blot?
Qual e’ la proteina che mi interessa? SDS-PAGE (non certo) Si basa sul confronto di peso molecolare Western blot (certo) Si basa su una reazione specifica antigene-anticorpo + – ?

31 A cosa serve il Western Blot?
Quanta proteina di interesse c’e’? Proteina di interesse Bande non specifiche [Proteina], pg

32 Fasi di un Western Blot Prima fase: elettroforesi su gel.
(Le proteine del campione vengono separate su un gel in base alle loro dimensioni) Seconda fase: trasferimento su membrana. (Le proteine nel gel sono poi trasferite su una membrana di nitrocellulosa mediante un campo elettrico) Terza fase: saturazione o “blocking”. (La saturazione e’ usata per prevenire le interazioni non specifiche tra l’anticorpo e la membrana)

33 Fasi di un Western Blot Quarta fase: legame dell’anticorpo primario.
(L’anticorpo riconosce la proteina specifica immobilizzata sulla membrana) Quinta fase: legame dell’anticorpo secondario. (L’anticorpo secondario, coniugato a un enzima (AP o HRP), riconosce specificamente l’anticorpo primario, gia’ legato alla proteina sulla membrana) Sesta fase: rivelazione o “detection”. (L’enzima coniugato all’anticorpo secondario scinde un substrato che, in corrispondenza della proteina specifica, sviluppa precipitato colorato o chemioluminescenza)

34 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Le proteine nel gel sono ancora in soluzione Le bande diffondono e si confondono col tempo E’ necessaria l’immobilizzazione per: Preservare in maniera permanente l’esperimento di elettroforesi Permettere il riconoscimento di proteine specifiche La strategia piu’ comune e’ il trasferimento su membrana Fatta di Nitrocellulosa, PVDF (Polivinilidene fluoride) o nylon Si usa l’elettroforesi, in un processo detto ‘blotting’

35 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
membrana

36 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Elettroblotting Apparato di trasferimento Il gel e’ messo tra strati di carta da filtro con la membrana a diretto contatto col gel sul lato verso l’elettrodo positivo Viene applicato un campo elettrico e le proteine migrano fuori dal gel verso l’elettrodo positivo e si legano alla membrana Fatto a 4°C per evitare surriscaldamento, decomposizione del tampone e degradazione delle proteine

37 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Trasferimento dal catodo (-) all’ anodo (+) Spugnette 3 fogli di carta da filtro imbevuti di tampone di trasferimento Gel Membrana Focus on left side of picture

38 Apparato per il trasferimento “Semi-dry”

39 Western Blotting - + SDS-PAGE Assemble ‘sandwich’ Wet blotting
Buffer-soaked filter papers Gel Nitrocellulose membrane Wet blotting Electrode Buffer Direction of transfer Semi-dry blotting Graphite Electrode Plates Nitrocellulose with bound proteins Stained (Red Ponceau)

40 Western blot: seconda fase Immobilizzazione e trasferimento
Componenti del tampone di trasferimento: 25mM Tris 190mM glicina 20% metanolo Have your gel/membrane sandwich together, pour in transfer buffer into apparatus, apply current and proteins are transferred from gel to membrane.

41 3 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

42 Western blot: terza fase saturazione o “blocking”
Per saturare i siti idrofobici liberi sulla membrana Per prevenire il legame dell’anticorpo primario alla membrana stessa Latte scremato o Albumina di Siero Bovino (BSA) reducing background

43 4 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

44 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario
L’anticorpo primario riconosce la proteina di interesse e non lega le altre proteine immobilizzate sulla membrana Anticorpi come sonde: Molto sensibili Possono essere “prodotti” Immunizzando una specie diversa (anticorpi policlonali) Generando anticorpi monoclonali (mAb) Economici

45 Anticorpi Ab + Ag AbAg Kd Kd = = 10-9 M [Ab] [AbAg]

46 Anticorpi Anticorpi (immunoglobuline, Ig) Una proteina a forma di Y secreta nel sangue in risposta ad uno specifico antigene, come un batterio o un virus, che neutralizza l’antigene legandosi specificamente ed esso e producendo una risposta immunitaria. There are 5 major classes of immunoglobulins, for example IgG and IgA, IgM, IgD, IgE

47 Anticorpi policlonali
Produzione Immunizzazione ripetuta dell’animale con l’antigene (peptide, proteina purificata o ricombinante) Il sangue e’ prelevato nel momento di picco di produzione dell’anticorpo ed e’ purificato il siero Il “pool” degli anticorpi riconosce molti epitopi dell’antigene usato per l’immunizzazione Animal most common goat, rabbit, mouse Antigen can be virus, protein, synthetic peptide (if you know the sequence) Some antibodies will be specific to injected antigen, mixed with antibodies that have been elicited by antigens throughout the lifetime of the animal

48 Anticorpi monoclonali
Riconoscono solo un epitopo Repeat immunization of animal with antigen Spleen removed, B-cell production, contains genetic information that gives rise to antibody production, each individual cell is making a specific antigen Spleen cells cannot be cultured, fused with myeloma cells that proliferate in vitro Resulting fused cells (hybridoma) screened by ELISA to select antigen specific antibodies, resulting in a monoclonal antibody Once a single hybridoma line is selected, injected into healthy mouse, produces tumor that produces a fluid rich in monoclonal antibodies, called ascites fluid Antibodies are then purified through various methods (Affinity chromotography)

49 Western blot: quarta fase incubazione con anticorpo primario

50 5 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

51 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

52 Anticorpi Anticorpo primario Anticorpo secondario
Riconosce la proteina Anticorpo secondario Lega l’anticorpo primario Generalmente prodotto in una specie diversa Coniugato con un enzima Il substrato dell’enzima sara’ convertito in un prodotto colorato Puo’ anche essere radioattivo o fluorescente

53 Western blot: quinta fase Incubazione con anticorpo secondario

54 6 overview 1. run protein on gel 2. transfer to membrane 3. block membrane to prevent non-specific binding 4. Probe membrane, primary ab bind to protein of interest, 2nd antibody binds to 1st antibody 5. substrate attaches to enzyme site on 2nd antibody, resulting in a colored protein band

55 Western blot: sesta fase rivelazione o “detection”
Fosfatasi alcalina (AP) o perossidasi del rafano (HRP: horseradish peroxidase) Conversione di un substrato colorimetrico in un precipitato colorato Substrati Chemioluminescenti Emettono luce se convertiti dall’enzima Possono essere visualizzati su lastre radiografiche Marcatura radioattiva Anticorpi secondarii biotinilati Directly on the gel: Cooblue nonspecifically binds to virtually all proteins, silver stain more sensitive, permanent Alkaline phosphatase (blue) horseradish perox. (brown) AP more commonly used in plants vs. HRP in animals (AP present in all tissues in the body- cross reactive, HRP enzyme derived from plant, so better to use AP in plant applications I 125 a two-step biotin/avidin system may be used. A biotinylated secondary antibody is applied first, then avidin conjugated to an enzyme or fluorochrome binds to multiple sites on the biotinylated secondary antibody, thus amplifying the signal and resulting in greater sensitivity than that achieved with an antibody-enzyme or antibody-fluorochrome conjugate alone.

56 HRP Western blot substrato luce Anticorpo primario Anticorpo secondario Rivelazione Il substrato metabolizzato dalla perossidasi (HRP) emette luce pg proteina