Fenotipo??? mutante T-DNA Gene Funzione REVERSE PCR-screening.

Presentazione sul tema: "Fenotipo??? mutante T-DNA Gene Funzione REVERSE PCR-screening."— Transcript della presentazione:

1 Fenotipo??? mutante T-DNA Gene Funzione REVERSE PCR-screening

2 La grande disponibilità di sequenze geniche conseguenti alla diffusione delle tecniche di sequenziamento del DNA e, specialmente, i grandi progetti di sequenziamento genomici, hanno rivoluzionato l’approccio alla determinazione della funzione di un gene. Frequentemente oggi si fa il percorso contrario; si parte da una sequenza genica ben caratterizzata e si risale alla sua funzione. Infatti, è possibile analizzare apposite librerie di mutanti per identificare tutti i mutanti di un gene d’interesse e conoscerne i fenotipi mutanti. Questo approccio che parte dal gene per risalire alla funzione è nota come genetica inversa (reverse genetics).

3 Strategie di screening per reverse genetics
Random Sequencing Strategy: Analisi di banche dati di FST (Flanking Sequence Tags) Pooling Strategy e Screening per PCR

4 48 linee indipendenti /pool
(72 inserzioni T-DNA ) Collezione di mutanti inserzionali Pool 1 Pool 8 48 x 8 384 linee (576 inserzioni T- DNA ) Super Pool A.1 Pool A.2 Hyper Pool A1.2 768 linee (1152 inserzioni T-DNA ) A1.1 50,000 linee (75,000 inserzioni) > 95% saturazione MegaPool 1536 linee (2304 inserzioni T-DNA )

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6 Protocollo di Screening
Qualità dei primers: specificità-sensibilità background con i primers T-DNA Screening per PCR di n HP: combinazione di un primer gene-specifico (F/R) ed un primer T-DNA (RB/LB) Analisi per ibridazione (transfer “sandwich”): sonda T-DNA (RB+LB) sonda gene-specifica Segnali coincidenti con le 2 sonde: PCR di conferma con primers T-DNA nested o con primers gene-specifici sequenza del frammento amplificato

7 Scelta dei Primers gene-specifici
T-DNA 5’ 3’ T-DNA T-DNA

8 Analisi fenotipica La base di qualunque strategia di mutagenesi è l’analisi fenotipica. Dopo aver effettuato la mutagenesi numerosi geni risulteranno mutati. Forse alcuni geni, per caso, non avranno subito alcuna mutazione, mentre in altri casi si potrebbero ottenere mutanti, con diversi livelli di perdita di funzione. Poichè le mutazioni sono di solito recessive, il primo passo consiste sempre in un’autofecondazione e nel passaggio alla T2. Qualora fossero presenti alleli mutati, un quarto di essi nella progenie risulterà omozigote e potrà manifestare nelle condizioni appropriate un fenotipo rispetto al wt. In alcuni casi però la mutazione è sterile o addiritura letale; in questi casi la si propaga allo stato eterozigote. Per identificare i fenotipi mutanti si effettua uno “screening”, in diverse condizioni di crescita. In alcuni casi le mutazioni sono facilmente visualizzabili anche a livello macroscopico. In altri casi, invece le mutazioni sono criptiche e si può cercare di evidenziare un fenotipo facendo crescere le piante in condizioni particolari.

9 Isolamento di mutanti inserzionali
Un esempio: Isolamento di mutanti inserzionali in geni appartenenti alla famiglia Dof

10 (DNA binding with One Finger)
PROTEINE DOF (DNA binding with One Finger) Fattori trascrizionali specifici del regno vegetale Caratterizzate da un singolo motivo “zinc finger” CX2C-X21-CX2C Il dominio Dof presenta un’identità aminoacidica del % Generalmente non presentano grosse omologie al di fuori del dominio conservato

11 1 [ : ] 61 1 DOF15_67_ LNCPRCNSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTEGGSLRNVPVGGSSRKNKRSSSS-- 2 DAG1_74_ VNCPRCNSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTEGGSLRNVPVGGSSRKNKRSSTP-- 3 DOF8_53_ VNCPRCNSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTEGGSLRNIPVGGGSRKNKRSHSS-- 4 DOF24_35_ LNCPRCNSLNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKDCRRYWTAGGSLRNIPVGGGVRKNKRSSSN-- 5 DOF10_349_ RNCPRCNSSNTKFCYYNNYSLAQPRYLCKSCRRYWTEGGSLRNVPVGGGSRKNKKLPFP-- 6 DOF23_35_ LRCPRCDSTNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKSCRRYWTKGGTLRNIPVGGGCRKNKRSTSS-- 7 DOF6_40_ LRCPRCDSTNTKFCYYNNYSLSQPRYFCKSCRRYWTKGGILRNIPIGGAYRKHKRSSSA-- 8 DOF11_73_ QKCPRCESTHTKFCYYNNYSLSQPRYFCKTCRRYWTKGGTLRNIPVGGGCRKNKKPSSS-- 9 DOF20_19_ QNCPRCESPNTKFCYYNNYSLSQPRYFCKSCRRYWTKGGTLRNVPVGGGCRRNKRSSSS-- 10 DOF28_25_ PSCPRCGSSNTKFCYYNNYSLTQPRYFCKGCRRYWTKGGSLRNVPVGGGCRKSRRPKSS-- 11 DOF31_38_ PACPRCASSNTKFCYYNNYSLSQPRYFCKGCRRYWTKGGSLRNIPVGGGCRKRSRSRQN-- 12 HPPBF-2a_110_ LPCPRCKSMETKFCYYNNYNINQPRHFCKACQRYWTAGGTMRNVPVGAGRRKNKSSSSH-- 13 DOF12_152_ LPCPRCNSMETKFCYYNNYNVNQPRHFCKKCQRYWTAGGTMRNVPVGAGRRKNKSPASH-- 14 DOF13_54_ LPCPRCNSMETKFCYYNNYNVNQPRHFCKACQRYWTSGGTMRSVPIGAGRRKNKNNSPT-- 15 HPPBF-2b_132_ IPCPRCESANTKFCYYNNYNVNQPRYFCRNCQRYWTAGGSMRNVPVGSGRRKNKGWPSS-- 16 DOF16_56_ LPCPRCNSADTKFCYYNNYNVNQPRHFCRKCQRYWTAGGSMRIVPVGSGRRKNKGWVSS-- 17 DOF29_62_ IPCPRCKSMETKFCYFNNYNVNQPRHFCKGCQRYWTAGGALRNVPVGAGRRKSKPPGRV-- 18 DOF9_58_ IACPRCKSMETKFCYFNNYNVNQPRHFCKGCHRYWTAGGALRNVPVGAGRRKSKPPGRV-- 19 DOF17_32_ LSCPRCESTNTKFCYYNNYNFSQPRHFCKSCRRYWTHGGTLRDIPVGGVSRKSS-KRSRT- 20 OBF_1_ ACRRYWTHGGTLRDVPVGGGTRKSA-KRSRT- 21 DOF18_29_ LPCPRCNSTTTKFCYYNNYNLAQPRYYCKSCRRYWTQGGTLRDVPVGGGTRRSSSKRHR-- 22 DOF32_95_ LKCPRCDSTNTKFCYFNNYSLTQPRHFCKACRRYWTRGGALRSVPVGGGCRRNKRTKNS-- 23 DOF7_89_ LKCPRCESTNTKFCYFNNYSLTQPRHFCKTCRRYWTRGGALRNVPVGGGCRRNRRTKSN-- 24 DOF5_94_ LKCPRCDSANTKFCYFNNYNLTQPRHFCKACRRYWTRGGALRNVPVGGGCRRNKKGKSG-- 25 DOF4_60_ LNCPRCDSTNTKFCYFNNYSLTQPRHFCKTCRRYWTRGGSLRNVPVGGGFRRNKRSKSR-- 26 DOF22_17_ LKCPRCDSSNTKFCYYNNYNLTQPRHFCKGCRRYWTQGGALRNVPVGGGCRRNNKKGKN-- 27 DOF2_29_ LKCPRCDSPNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKSCRRYWTKGGALRNVPVGGGSRKNATKRST-- 28 DOF1_33_ LKCPRCDSPNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKNCRRYWTKGGALRNIPVGGGTRK-SNKRSGS- 29 DOF3_50_ LKCPRCNSLNTKFCYYNNYNLSQPRHFCKNCRRYWTKGGVLRNVPVGGRSRK--AKRSKTK 30 DOF21_41_ LKCPRCNSPNTKFCYYNNYSLSQPRHFCKSCRRYWTRGGALRNVPIGGGCRK--TKKSIKP 31 DOF19_40_ LKCPRCDSVNTKFCYYNNYSLSQPRHYCKNCRRYWTRGGALRNVPIG-GSTRNKNKPCSLQ 32 DOF30_27_ LKCPRCDSSNTKFCYYNNYSLSQPRHFCKACKRYWTRESEFLSSGFSSLSALGLGLPHQ-- 33 DOF27_24_ RVCPRCDSDNTKFCFYNNYSESQPRYFCKNCRRYWTHGGALRNIPVGGSCRKPKRLKVD-- 34 DOF25_21_ RVCPRCYSDQTRFSYFNNNKKSQPRYKCKNCCRCWTHGGVLRNIPVTGICDKSNLPKID-- 35 DOF26_25_ RVCARCDSDNTKFCYYNNYSEFQPRYFCKNCRRYWTHGGALRNVPIGGSS-RAKRTRINQ- 36 DOF14_25_ RVCARCDSDNTKFCYYNNYCEFQPRYFCKNCRRYWTHGGALRNIPIGGSS-RAKRARVNQ- consensus/70% l.CPRCsSsNTKFCYYNNYslsQPRaFCKsCRRYWTcGGsLRNlPVGGGsR+spp.pss

12 Isolamento del mutante inserzionale
nel gene Dof DAG1 T-DNA +1 ATG 5'UTR Dof 3'UTR PCR su 29 HPs con le 2 coppie di primers Analisi su gel dei prodotti di PCR Blotting a “sandwich” Ibridazione sia con la sonda DAG1 che con la sonda T-DNA

13 + Sonda DAG1 Sonda T-DNA