XXI CICLO DEL DOTTORATO IN MEDICINA MATERNO-INFANTILE, PEDIATRIA DELLO SVILUPPO E DELLEDUCAZIONE, PERINATOLOGIA Dottoranda: dr. Erica Valencic Tutore:

Presentazione sul tema: "XXI CICLO DEL DOTTORATO IN MEDICINA MATERNO-INFANTILE, PEDIATRIA DELLO SVILUPPO E DELLEDUCAZIONE, PERINATOLOGIA Dottoranda: dr. Erica Valencic Tutore:"— Transcript della presentazione:

1 XXI CICLO DEL DOTTORATO IN MEDICINA MATERNO-INFANTILE, PEDIATRIA DELLO SVILUPPO E DELLEDUCAZIONE, PERINATOLOGIA Dottoranda: dr. Erica Valencic Tutore: dr. Alberto Tommasini Trieste, 29 settembre 2008

2 Verificare che cellule staminali mesenchimali (MSC) isolate dalla matrice del cordone ombelicale mostrino le stesse capacità di quelle isolate dal midollo osseo (MO). PERCHE MSCs da MO non sono immunogeniche e sono in grado di modulare la risposta immune. Interesse clinico: ricostituire il microambiente midollare danneggiato dalla chemio-radio terapia, accelerare lemopoiesi dopo il trapianto e regolare e ridurre la GVHD. Il cordone ombelicale è facilmente ottenibile e contiene cellule biologicamente più giovani. IL PROGETTO

3 COME 1. Cordoni ombelicali (20 cm) da partorienti sane con gravidanza a termine. 2. Il cordone viene tagliato in pezzi di circa 3 cm di lunghezza. 3. I vasi vengono incannulati e rimossi dal tessuto circostante con un bisturi. 4. Il tessuto rimasto viene ridotto a piccoli frammenti con un bisturi. 5. I frammenti vengono trasferiti in piastre con del terreno. 6. Dopo 10 gg. le cellule iniziano a migrare dal tessuto e i frammenti vengono tolti dalle piastre. Cellule piccole Cellule grandi

4 QUINDI Utilizzo di terreno DMEM con fattori di crescita diversi: siero fetale bovino (FBS) al 20% liquido follicolare (L.F.) al 20% (pool ottenuto da diverse pazienti della PMA) 10% FBS e 10% L.F. Nei primi passaggi poche differenze morfologiche tra i diversi fattori di crescita: in presenza di LF le cellule sono un po più rotondeggianti mentre con FBS sono più simili ai fibroblasti. Nei successivi passaggi: Le cellule con FBS o L.F.: rallentano la crescita fino a fermarsi. Cellule con entrambi i fattori FBS/L.F.: elevata capacità di replicarsi (raddoppiamento < 24 ore); stabilità morfologica. Si è quindi deciso di coltivare le cellule in tre condizioni diverse: 20% di FBS 10% di FBS e 5% di LF 10% di FBS e 10% di LF

5 CONFRONTO TRA I TRE METODI Test di apoptosi Test di senescenza Immunofenotipo Espressione della proteina HMGA-1 (marker di staminalità mesenchimale) Non differenze significative, tranne maggior espressione di HMGA-1 in cellule coltivate con solo FBS.

6 FUNZIONE REGOLATORIA Le cellule coltivate con 10% FBS-10% LF sono state co-coltivate per 3 giorni con linfo-monociti (PBMC) marcati con CFSE (un colorante fluorescente che permette di analizzare la proliferazione cellulare) e stimolati con PHA. Lesperimento è stato ripetuto per due volte con: - mesenchimali irradiate e non - in piastre che permettono il contatto tra le due popolazioni cellulari e in piastre che non lo permettono (transwell). => le MSC riducono la proliferazione dei PBMC in entrambi i replicati; => con le mesenchimali irradiate i risultati sono variabili; => nessuna soppressione in transwell.

7 Il dosaggio delle citochine conferma lazione immunomodulatoria delle cellule mesenchimali: diminuzione dellIL-2 e dellIFN-γ, mentre IL-6 aumenta ma anche le mesenchimali da sole ne producono grandi quantità. Questi risultati suggeriscono che il contatto cellulare sia indispensabile per lazione immunomodulatrice delle mesenchimali. Allora qual è il ruolo dellHLA-G,molecola solubile, descritta in letteratura come la responsabile della soppressione?

8 CONCLUSIONI I risultati ottenuti finora suggeriscono che laggiunta del liquido follicolare nel terreno di coltura modifichi la morfologia cellulare e renda le cellule più longeve mentre i parametri studiati, ad eccezione dellespressione dellHMAG-1, non differiscono significativamente. La funzione regolatoria è stata studiata solo sulle cellule mesenchimali coltivate con terreno addizionato di 10% FBS e 10% LF e si è osservata una riduzione della proliferazione dei PBMC. Nei prossimi mesi testeremo la funzione regolatoria delle mesenchimali coltivate con FBS verificando anche la funzione dellHLA-G con un anticorpo che ne blocchi lattività. Infine si sta pensando anche di utilizzare come sostituti dellFBS il lisato piastrinico e il siero del sangue cordonale.