LINEA DI RICERCA N° 1 - STUDI DI RIGENERAZIONE TISSUTALE.

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1 LINEA DI RICERCA N° 1 - STUDI DI RIGENERAZIONE TISSUTALE.
Studio di un modello in vitro per la rigenerazione di sostituti dell’orecchio medio (OM) mediante ingegneria tissutale. Perdita della conducibilità uditiva infezioni croniche, difetti genetici, traumi, malattie degenerative Europa = persone Incidenza (per anno) Italia = persone Ingegneria Tissutale Catena degli Ossicini MembranaTimpanica

2 Cellule staminali mesenchimali
Le attuali strategie chirurgiche consistono nella: - rimozione delle strutture danneggiate ricostruzione con materiale autologo ESTRUSIONE impiego di materiali biologici o sintetici Esigenza di nuove opzioni chirurgiche ricostruttive SCOPO Sviluppare nuovi costrutti ingegnerizzati per i tessuti dell’orecchio medio Progettare un sistema biomimetico utilizzabile in vitro per validare le protesi per l’OM Nuovi biomateriali Cellule staminali mesenchimali Stimoli meccanici U.O. Otorinolaringoiatria, Audiologia e Foniatria Universitaria di Pisa Prof. Berrettini S. Conoscenza specifica del settore audiologico Competenze di ingegneria tissutale e di analisi ultrastrutturali U.O. di Ematologia Universitaria di Pisa Prof. Petrini M. Isolamento e caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali BIOLAB del Dip. di Chimica e Chimica Industriale Dr.ssa Chiellini F. Sintesi di biomateriali e tecniche avanzate di elaborazione di scaffold Crim Lab., Scuola Superiore Sant’Anna Ing. Stefanini C. Micro-meccanica e ingegneria bio-meccanica

3 Fibroblasti della MT Collagene II Osteoblasti
Creazione di costrutti bioibridi; induzione del differenziamento cellulare e applicazione di stimolazioni meccaniche Sono state eseguite analisi di: vitalità delle cellule seminate sui biomateriali (test spettrofotometrici di valutazione della proliferazione e del metabolismo) distribuzione delle cellule sugli scaffold (microscopia confocale e microscopia elettronica a scansione) contenuto di DNA totale (test fluorimetrici) espressione di alcuni geni di interesse (qPCR di molecole di differenziamento e della matrice extracellulare) espressione proteica delle proteine di interesse (western blotting) morfologia delle cellule coltivate e differenziate sugli scaffold (citochimica ed immunocitochimica) Risultati preliminari: - Le cellule risultano essere vitali sui vari tipi di biomateriali utilizzati e sono in grado di differenziarsi nel fenotipo desiderato mediante gli opportuni stimoli chimici somministrati Gli stimoli meccanici biomimetici, insieme con gli stimoli chimici, sono in grado di variare ulteriormente l’espressione di alcune molecole di differenziamento e della matrice extracellulare Work in progress Danti S, D’Alessandro D, Pietrabissa A, Petrini M, Berrettini S. Development of tissue-engineered substitutes of the ear ossicles: PORPshaped poly(propylene fumarate)-based scaffolds cultured with human mesenchymal stromal cells. J Biomed Mater Res A. 2010, 92: Danti S, Stefanini C, D’Alessandro D, Moscato S, Pietrabissa A, Petrini M, Berrettini S. Novel biological/biohybrid prostheses for the ossicular chain: fabrication feasibility and preliminary functional characterization. Biomedical Microdevices. 2009, 11: Fibroblasti della MT Collagene II Osteoblasti

4 stimolo meccanico stimolo elettrico
LINEA DI RICERCA N° 2 – STUDIO DELLE PROPRIETA’ BIOMEDICHE DELLE NANOPARTICELLE Studio delle interazioni tra sistemi viventi e sistemi nanoparticellari con particolari proprietà fisiche intrinseche Nanotubi di nitruro di boro (BNNT) Nanoparticelle di Titanato di Bario (BTNP) stimolo meccanico stimolo elettrico Piezoelettricità Queste nanoparticelle si comportano da nanotrasduttori a livello cellulare attivabili tramite stimoli esterni. Sono nanosistemi con elevata potenzialità applicativa nello sviluppo di device minimamente invasivi. Ing. Ciofani - Istituto Italiano delle Tecnologie (IIT), Ing. Danti e Dr. D’Alessandro - Dip. di Neuroscienze dell’Università di Pisa

5 verificare che il meccanismo di endocitosi è energia-dipendente
Studi di citocompatibilità di BNNT e BNTP condotti su vari tipi cellulari (umani ed animali) responsivi alla stimolazione elettrica (mioblasti, cardiomioblasti, cellule di tipo neuronale, osteoblasti primari umani, cellule staminali della polpa dentale etc.) hanno permesso di : mettere a punto metodiche per valutare gli effetti di queste nanoparticelle sulla vitalità, sul metabolismo, l’apoptosi ed il differenziamento cellulare identificare la dose efficace da somministrare alle colture senza avere effetti avversi verificare la localizzazione intracellulare delle nanoparticelle, principalmente all’interno di vescicole citoplasmatiche (Confocale, TEM) verificare che il meccanismo di endocitosi è energia-dipendente Messa a punto dei sistema di stimolazione ultrasuoni-BNNT : - applicato a modelli di cellule neuronali come PC12 e neuroblastoma umano può stimolare in 9 giorni la crescita dei neuriti fino al 30% con significatività statistica applicato a osteoblasti primari umani, porta gli stessi a raggiungere velocemente un fenotipo maturo, rivelato dall’incremento della produzione di osteocalcina e calcio-fosfato Ciofani G, Ricotti L, Danti S, Moscato S, Nesti C, D'Alessandro D, Dinucci D, Chiellini F, Pietrabissa A, Petrini M, Menciassi A. Investigation of interactions between poly-L-lysine-coated boron nitride nanotubes and C2C12 cells: up-take, cytocompatibility, and differentiation. Int J Nanomedicine. 2010, 5: Ciofani G, Danti S, D'Alessandro D, Ricotti L, Moscato S, Bertoni G, Falqui A, Berrettini S, Petrini M, Mattoli V, Menciassi A. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 2010, 4: Ciofani G, Danti S, D'Alessandro D, Moscato S, Petrini M, Menciassi A. Barium titanate nanoparticles: highly cytocompatible dispersions in glycol-chitosan and doxorubicin complexes for cancer therapy. Nanoscale Res Lett. 2010, 5: