TECNICHE DI VOLTAGE-CLAMP A DUE ELETTRODI

Presentazione sul tema: "TECNICHE DI VOLTAGE-CLAMP A DUE ELETTRODI"— Transcript della presentazione:

1 TECNICHE DI VOLTAGE-CLAMP A DUE ELETTRODI
TECNICA DEL PATCH-CLAMP REGISTRAZIONI CON MATRICI DI ELETTRODI STRUTTURA E FUNZIONE DEL RECETTORE IONOTROPO PER L’ACh STRUTTURA E FUNZIONE DEI CANALI IONICI VOLTAGGIO DIPENDENTI

2 TECNICHE DI VOLTAGE-CLAMP
Permettono di: misurare i flussi di ioni attraverso la membrana come corrente elettrica, mentre la differenza di potenziale ai sui capi è mantenuta costante per mezzo di un amplificatore a retroazione (FBA) separare la componente di corrente ionica da quella capacitiva ottenere informazioni sul funzionamento dei canali ionici (permeabilità e gating)

3 In esperimenti di voltage-clamp il voltaggio ai capi della membrana è forzato a variare il più rapidamente possibile da un valore stazionario ad un altro valore sempre stazionario: si applica alla membrana un gradino di potenziale. Quando V varia si osserva un rapido flusso di corrente capacitiva di natura transiente, ma quando V è stazionario la corrente è puramente ionica perchè Ic= C dV/dt = 0

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5 Per ogni particolare preparato cellulare la condizione di voltage-clamp si verifica quando vengono garantite le seguenti condizioni: un accurato controllo del voltaggio un’adeguata velocità l’isopotenzialità dell’area di membrana da cui si registra la corrente (space clamp)

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7 con guadagno A, confronta Vm con il potenziale di comando E; se la differenza fra Vm ed E è diversa da zero invia corrente I attraverso la resistenza d’accesso Ra (elettrodo e citoplasma) Misura Vm, (alta resistenza d’ingresso) quindi maggiore è A, guadagno dell’ampificatore, più Vm approssima E e l’effetto della resistenza d’ingresso diventa trascurabile Si può dimostrare che

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10 METODI DI SEPARAZIONE DELLE CORRENTI
Sostituzione ionica Separazione farmacologica Protocolli di impulsi di voltaggio

11 SOSTITUZIONE IONICA

12 SEPARAZIONE FARMACOLOGICA

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14 PROTOCOLLI DI IMPULSI DI VOLTAGGIO

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17 TECNICA DEL PATCH-CLAMP
Permette la registrazione con alta risoluzione (fino a livello di singolo canale) di: correnti in pezzi di membrana della cellula (cell-attached) correnti in pezzi di membrana isolati dalla cellula (excised membrane patches: inside-out, outside-out) correnti e potenziali in cellule di piccole dimensioni (whole-cell current-clamp e voltage-clamp)

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20 Convertitore corrente-voltaggio
La corrente in ingresso è = alla corrente di feedback

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26 Intracellular messenger

27 intracellular messengers
antibodies peptides

28 extracellular messengers
antibodies peptides