Farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 1 1) RECETTORI DI MEMBRANA Complessi macromolecolari che trasducono allinterno delle cellule informazioni.

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1 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 1 1) RECETTORI DI MEMBRANA Complessi macromolecolari che trasducono allinterno delle cellule informazioni mediate da molecole che non attraversano la membrana plasmatica RECETTORI CANALE RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G RECETTORI PER I FATTORI DI CRESCITA RECETTORI PER LADESIONE CELLULARE RECETTORI PER LE CITOCHINE RECETTORI CON ATTIVITA GUANILATO-CICLASICA INTRINSECA 2) RECETTORI INTRACELLULARI Proteine citoplasmatiche o nucleari che legano molecole liposolubili e sono in grado di controllare lespressione genica

2 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 2 RECETTORI CANALE chiamati anche canali ionici controllati da ligando complessi macromolecolari formati da subunità proteiche che delimitano un canale idrofilico subunità costituite da singole catene polipeptidiche che attraversano la membrana da 1 a 6 volte (M1-M6) la formazione del complesso ligando-recettore causa lapertura del canale e un rapido e selettivo flusso ionico in entrata o uscita

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4 4 RECETTORI ACCOPPIATI A PROTEINE G Costituiti da una singola catena polipeptidica con 7 regioni transmembrana

5 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 5 LE PROTEINE G Proteine G eterotrimeriche costituite da 3 subunità: α (circa 20 isoforme), β (5 isoforme) e γ (10 isoforme) la subunità α è dotata di attiviyà ATP-asica in seguito allattivazione recettoriale, la subunità α si separa dal complesso βγ sia α, sia il complesso βγ interagiscono con sistemi effettori subunità αs adenilil-ciclasi (+) β 1 - β 2 -adrenergici, D 1, 5HT 4, ACTH, FSH, canali al calcio (+) LH, GnRH, GHRH, V 2 subunità αi 1,2,3 adenilil-ciclasi (-) α 2 -adrenergico, D 2, 5HT 1, M 2 subunità αq fosfolipasi C (+) α 1 -adrenergico, 5HT 2, TSH, TRH, GnRH, V 1 subunità α0 1,2 canali al calcio (-) α 2 -adrenergico, M 2 canali al potassio (+)

6 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 6 LE PROTEINE G Proteine G monomeriche possiedono attività intrinseca GTP-asica la loro attivazione dipende dal legame con una molecola di GTP lo scambio GDP-GTP è regolato dallinterazione con specifiche proteine (per es. Sos, attivata da recettori per fattori di crescita) lattivazione delle proteine G monomeriche favorisce linterazione con i sistemi effettori Ras attivazione della cascata delle MAP chinasi ERK1 e 2 Rap1 inibizione di Ras e attivazione Ras-indipendente di ERK1 e 2 Rac controllo delle risposte allo stress cellulare ( induzione dellapoptosi mediante attivazione di JNK) Rab trasporto ed esocitosi di vescicole Rho assemblaggio del citoscheletro EF-2 regolazione della sintesi proteica nei ribosomi

7 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 7 RECETTORI PER FATTORI DI CRESCITA

8 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 8

9 9 RECETTORI INTRACELLULARI

10 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 10 I neurotrasportatori possono essere suddivisi in tre famiglie: trasportatori della membrana cellulare Na+ / K+ - dipendenti (per lacido glutammico) trasportatori della membrana cellulare Na+ / Cl- - dipendenti (per il GABA, le catecolamine e la serotonina) trasportatori della membrana vescicolare H+ - dipendenti (per le monoamine, lacetilcolina e gli aminoacidi)

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12 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 12

13 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 13

14 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 14 Sistemi di trasduzione del segnale dei recettori adrenergici 1 -adrenocettori 2 - e -adrenocettori I recettori 1 attivano la fosfolipasi C. I recettori 2 inibiscono ladenilato ciclasi (aumentano la permeabilità al K +, riducono la permeabilità al Ca 2+ ). I recettori attivano ladenilato ciclasi.

15 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 15 Distribuzione e principali funzioni dei recettori α-adrenergici recettoretessutorisposta 1 Muscolo radiale dellirideContrazione Muscolatura liscia dei vasiContrazione Muscolatura liscia degli sfinteriContrazione FegatoGlicogenolisi, gluconeogenesi SNCVeglia, secrezione ACTH, LH 2 Terminazioni SNVInibizione release NA e ACh PiastrineAggregazione SNCInibizione centri vasomotori Inibizione presinaptica

16 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 16 Distribuzione e principali funzioni dei recettori -adrenergici recettoretessutorisposta 1 CuoreEffetto cronotropo, dromotropo, batmotropo e inotropo positivo ReneAumento secrezione renina 2 Muscolatura liscia dei vasi nel muscolo scheletrico Rilassamento Muscolatura liscia di stomaco e intestino Rilassamento Muscolatura liscia dei bronchiRilassamento Muscolo scheletricoGlicogenolisi FegatoGlicogenolisi 3 Tessuto adiposoLipolisi

17 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 17 VIE COLINERGICHE

18 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 18

19 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 19 recettore nicotinico

20 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 20 recettore M1 ACh via di trasduzione del segnale del recettore M1

21 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 21 vie di trasduzione del segnale del recettore M2

22 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 22 Distribuzione e principali funzioni dei recettori colinergici recettoretessutorisposta 1) 2 β1 δ ε Muscolo scheletricoContrazione 7) 5 4) 22) 3 SNCAttenzione, memoria Stimolazione VTA 4) 2 4) 3 gangli del SNVStimolazione SNCAttenzione, funzioni cognitive StomacoAumento secrezione acida CuoreEffetto cronotropo e inotropo negativo SNC e SNVInibizione presinaptica

23 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 23 Distribuzione e principali funzioni dei recettori colinergici recettoretessutorisposta Muscolatura liscia bronchialeContrazione Muscolo sfintere pupillareContrazione Muscolo ciliareContrazione IntestinoAumento peristalsi e rilassamento sfinteri Ghiandole bronchiali, salivari, sudoripare Aumento secrezione VasiRilassamento muscolatura liscia (mediato da NO) VescicaContrazione muscolo detrusore

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25 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 25

26 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 26 FASCICOLO MEDIALE PROENCEFALICO AREA TEGMENTALE VENTRALE SUBSTANTIA NIGRA CORTECCIA FRONTALE e CINGOLATA ANTERIORE NUCLEO ACCUMBENS AMIGDALA CORTECCIA ENTORINALE CORTECCIA PIRIFORME AREA DEL SETTO CORPO STRIATO 1 2 3 1 – VIA MESOLIMBICA 2 – VIA MESOCORTICALE 3 – VIA NIGROSTRIATALE 4 - VIA TUBERO- INFUNDIBOLARE VIE DOPAMINERGICHE 4

27 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 27 Distribuzione e principali funzioni dei recettori dopaminergici recettoretessutorisposta D1 ( AMP c ) Vasi (area splancnica e rene)Rilassamento muscolatura liscia SNC (corteccia frontale)Funzioni cognitive D2 ( AMP c ) SNC (sistema limbico)Controllo dellumore e dello stato affettivo SNC (striato)Controllo del movimento SNC (ipotalamo)Inibizione della liberazione di prolattina

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29 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 29

30 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 30

31 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 31 Distribuzione e principali funzioni dei recettori serotoninergici recettoretessutorisposta SNC (localizzazione somatodendritica, nuclei del rafe) Inibizione firing neuroni serotoninergici SNC (localizzazione postsinaptica, sistema limbico) Controllo del tono dellumore Riduzione dellansia SNC (ipotalamo)Aumento secrezione ACTH SNCAuto- ed eterorecettore ad azione inibitoria SNC (talamo, corteccia cerebrale)Controllo dellacquisizione e dellelaborazione degli stimoli sensoriali SNC (pavimento IV ventricolo)emesi

32 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 32 GABA E GLUTAMMATO: SINTESI E CATABOLISMO

33 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 33 SINAPSI GABAERGICA

34 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 34 RECETTORE GABA-A

35 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 35 bicucullina

36 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 36 composizione recettore profilo farmacologico 1 n 2 elevata affinità per BDZ, imidazopiridine e β- carboline 1 n 3 come sopra, 1/400 affinità per imidazopiridine 2 n 2 elevata affinità per BDZ e imidazopiridine 2 n 1 come sopra, ma ~1/10 affinità per agonisti. Insensibile al flumazenil 4 n 2 insensibile a BDZ e imidazopiridine. Flumazenil è agonista 5 1-3 2 elevata affinità per BDZ, insensibile a imidazopiridine 6 1 2 insensibile alle BDZ. Flumazenil è agonista parziale e alcuni agonisti inversi a struttura β-carbolinica sono antagonisti

37 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 37 RECETTORE GABA-B

38 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 38 SINAPSI GLUTAMMATERGICA

39 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 39 Recettori AMPA

40 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 40 Recettori NMDA

41 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 41 Recettori metabotropici per il glutammato GRUPPO I ( canali al Ca 2+ canali al K + ) mGlu1,5 Potenziano la funzione dei recettori AMPA e NMDA GRUPPO II ( canali al Ca2+ canali al K+) mGlu2,3 Mantengono la trasmissione glutammatergica nel range fisiologico, prevenendo la ipereccitabilità neuronale GRUPPO III mGlu4,6,7,8 Come sopra

42 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 42 GLUTAMMATO E PLASTICITA SINAPTICA

43 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 43 GLUTAMMATO ENDOGENO GLUTAMMATO ESOGENO ECCITOTOSICITA DA GLUTAMMATO

44 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 44 FARMACO + RECETTORE COMPLESSO FARMACO-RECETTORE EFFETTO k2 [ D ] + [ R ] [ DR ] Vass = k1[D][R] Vdiss = k2[DR] k1 Allequilibrio Vass = Vdiss k1[D][R] = k2[DR] k2 / k1 = K D = [D][R] / [DR] Poiché [R] = [RT] – [DR] K D = [D] ( [RT] – [DR] ) / [DR] [DR] / [RT] = [D] / K D + [D] in cui : [DR] / [RT] = r è la frazione di recettori occupati dal farmaco ( 0 r 1 ) K D è la costante di dissociazione allequilibrio

45 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 45 TEORIA DELLOCCUPAZIONE la combinazione tra una molecola di farmaco ed un recettore è un evento del tipo tutto o nulla il legame farmaco – recettore è reversibile esiste sommazione dei singoli stimoli che derivano dalla formazione del complesso farmaco – recettore loccupazione di un recettore non influenza loccupazione di altri recettori leffetto osservato è proporzionale alla frazione di recettori occupati dal farmaco leffetto massimo viene raggiunto quando tutti i recettori sono occupati r = [DR] / [RT] = E / Emax E / Emax = [D] / [D] + K D quando E è uguale al 50% delleffetto massimale 1 / 2 = [D] / [D] + K D [D] = K D - Secondo la teoria delloccupazione, la concentrazione o la dose di farmaco che produce un effetto pari al 50% delleffetto massimale (DE 50 o CE 50 ) è uguale alla K D del farmaco stesso - La K D del farmaco, secondo la teoria delloccupazione, può perciò essere calcolata direttamente dalla curva dose-risposta

46 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 46

47 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 47 Metodi di studio del legame farmaco – recettore linterazione tra farmaco e recettore presenta analogie con linterazione enzima-substrato lequazione B = [D] Bmax / KD + [D] in cui B indica la concentrazione di farmaco legato, equivalente a [DR], e Bmax indica il legame totale, equivalente a RT, è formalmente uguale allequazione di Michaelis-Menten e prende il nome di isoterma di legame o isoterma di Langmuir lisoterma di legame e le sue trasformazioni lineari permettono di calcolare direttamente il valore della KD di un farmaco e il valore di Bmax

48 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 48 Trasformazione lineare di Scatchard La relazione iperbolica che descrive linterazione farmaco – recettore può essere trasformata in una relazione lineare per ottenere una più facile interpolazione dei dati sperimentali B = [D] B max / K D + [D] B / F = - (1 / K D ) B + (B max / K D ) (F è la concentrazione del farmaco libero ed è equivalente a [D])

49 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 49 Isoterma di legame di saturazione ([3H]prazosina - 1 recettore) Concentrazioni [3H]prazosina: 0,05 – 1,0 nM Spiazzante: fentolamina 10 M 19000 cellule / tubo (aorta toracica di coniglio) Temperatura: 32°C Tempo di incubazione: 30 min K D = 0,14 0,01 nM Bmax = 2,77 0,09 x 10 - 4 fmol/cellula

50 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 50 Studio di inibizione del legame [3H]prazosina - 1 recettore Concentrazione [3H]prazosina: 0,2 nM Spiazzante: fentolamina 10 M Tipo di cellule, numero di cellule/tubo, temperatura e tempo di incubazione come in precedenza Le pK I (-log K I ) dei tre composti (WB 4101 = 9,43 ; 5-metilurapidile = 9,29 ; spiperone = 8,32) sono state calcolate dai relativi valori di IC50 mediante lequazione di Cheng e Prusoff: K I = IC50 / (1 + 0,2 nM / 0,14 nM)

51 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 51 MODIFICAZIONI ALLA TEORIA DELLOCCUPAZIONE Ariens e Stephenson, verso la metà degli anni 50, apportarono sostanziali modifiche alla teoria enunciata da Clark: la relazione tra occupazione del recettore ed effetto non è lineare (per uno stesso farmaco il valore di ED 50 è diverso da quello di K D ) leffetto massimo può essere prodotto da un farmaco quando è occupata solo una frazione dei recettori (esiste una riserva recettoriale)

52 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 52 farmaci differenti possono avere diversa efficacia nellattivare uno stesso recettore E / Emax = [DR] / [RT] E / Emax = [D] / [D] + KD = 1 agonisti completi = 0 antagonisti 0 < < 1 agonisti parziali E / Emax = f (S) S = e [D] / [D] + KD E / Emax = f ( e[D] / [D] + KD) In questa equazione e = efficacia può variare da zero ad un alto numero positivo

53 farmaco / tossicologia cellulare e molecolare 53 Relazione tra dose (o concentrazione ) e risposta di tipo graduale - Gli effetti graduali sono misurabili in continuo, cioè possono assumere qualsiasi valore aumentando con laumentare della dose o della concentrazione e tendendo asintoticamente ad un valore massimo - la posizione di una curva dose-risposta sullasse delle ascisse determina la potenza di un farmaco - laltezza della curva dose-risposta, determinata dalleffetto massimale che un farmaco può produrre, descrive lefficacia del composto