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DAL DNA ALLE PROTEINE la trascrizione genica
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Tratti della sequenza di DNA vengono trascritti in RNA
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Ogni gene può essere trascritto e tradotto con diversi gradi di efficienza
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Cosa è necessario per la trascrizione?
DNA stampo RNA polimerasi Ribonucleosidi Trifosfati: ATP, GTP, CTP, UTP
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I più comuni RNA: rRNA, mRNA e tRNA
Regolata da segnali di inizio e termine Complementarietà delle basi azotate dei nucleotidi
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Modello a “chela di granchio” dell’RNA polimerasi
Viene copiata in RNA una sola elica di DNA : elica di senso o filamento stampo
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RNA complementare allo stampo è uguale al filamento codificante (al posto di T c’è U)
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L’RNA pol batterica: 4 subunità a cui si associano:
fattore :per riconoscere l’inizio fattore ρ che riconosce i segnali di terminazione
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Promotori sequenza all’inizio del gene
La subunità associata a RNA pol riconosce il promotore, stabilisce la direzione della trascrizione RNA pol trascrive la catena di senso
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L’ORIENTAMENTO del promotore determina quali tratti di DNA devono essere trascritti
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La doppia elica si apre e inizia la sintesi di RNA dal nucleotide +1 rispetto al promotore
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Ribonucleoside-PPP + RNAn= PP + RNAn+1
LEGAME FOSFODIESTRICO
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RNA cresce in direzione 5’-3’
La trascrizione termina in sequenze del DNA ricche di CG Può intervenire il fattore ρ: si lega alla RNA pol e permette il suo distacco dal DNA
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TERMINATORE RHO INDIPENDENTE
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TERMINATORE ρ DIPENDENTE
Attività ATPasica
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mRNA batterici Pochi eventi di maturazione Appena trascritti vengono tradotti Alcune basi vengono metilate, piccola coda di rnt A
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Procarioti: controllo espressione genica
Batteri: regolazione della trascrizione nella fase iniziale Più geni sotto controllo di un solo promotore Operone: tratto di DNA che contiene promotore, operatore e geni strutturali
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Operone lattosio Il lattosio viene scisso in galattosio e glucosio da 3 enzimi Gli enzimi vengono indotti solo in presenza di lattosio!!
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La cellula usa preferibilmente glucosio: lac spento
Quando non c’è glucosio si lega CAP Quando non c’è lattosio si lega il repressore Il lattosio agisce sul repressore e lo stacca
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OPERONE DEL TRIPTOFANO (TRP)
La presenza di Trp fa legare il repressore e la trascrizione si blocca; viene prodotto Trp solo in caso di necessità
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NUMEROSE PROTEINE PARTECIPANO ALLO STADIO INIZIALE DELLA TRASCRIZIONE
Eucarioti RNA pol I rRNA RNA pol II mRNA, piccoli RNA nucleari, microRNA RNA pol III tRNA, piccoli RNA citoplasmatici Queste RNA pol riconoscono promotori diversi Promotori eucariotici più complessi di quelli procariotici NUMEROSE PROTEINE PARTECIPANO ALLO STADIO INIZIALE DELLA TRASCRIZIONE
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Eucarioti RNA pol hanno bisogno di FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE: legame al promotore TFIIA-B-D-E-F-H-J (per RNApol II)
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Promotori eucariotici
Es. RNA pol II: TATA box al -30/-25 e CAAT box al -80 TATA è riconosciuta da TBP, una proteina componente di TFIID
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TBP riconosce TATA TBP+TAF= TFDII
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Sequenze di DNA (-200) legano attivatori (recruitment) della RNA pol II
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Gli attivatori legano il DNA e il complesso mediatore o direttamente il complesso di trascrizione
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Maturazione dell’mRNA eucariotico
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Procarioti: mRNA poligenico: presenza di più geni in una stessa unità trascrizionale
Eucarioti: mRNA monogenico, cioè prodotto di trascrizione di un singolo gene
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Maturazione mRNA eucariotico è complessa
1- aggiunta del CAP al 5’: GMP con gruppo metilico 2- taglio e coda di poli A (nucleotidi con adenina) al 3’ 3- splicing 4- editing
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CAP: protegge 5’ e favorisce l’inizio della traduzione
Taglio e poli A: regolazione traduzione e stabilità di mRNA
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Il pre-mRNA è più lungo di mRNA maturo
Lo SPLICING (taglia e cuci) permette di rimuovere gli introni
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Riconoscimento preciso dei punti di taglio introne-esone e di giunzione esone-esone
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Spliceosoma: snRNP, formate da piccoli RNA e proteine
SnRNP U: U perché l’RNA è ricco di uridina
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Stesso trascritto primario, prodotti proteici diversi
SPLICING ALTERNATIVO Stesso trascritto primario, prodotti proteici diversi Combinazioni differenti di esoni Circa il 50% dei geni umani subisce splicing alternativo
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Splicing alternativo della tropomiosina nel muscolo striato e liscio
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Editing dell’RNA Cambiamento dopo la trascrizione dell’mRNA Addizione e/o delezione di residui di U in diversi siti della molecola, o cambiamento di molte U in C Modificazione di C e A
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Gli mRNA vengono esportati nel citoplasma attraverso il complesso del poro nucleare
Intervengono proteine per questo processo
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Regolazione della trascrizione negli eucarioti
L’espressione dei geni eucariotici è controllata essenzialmente all’inizio della trascrizione, anche se può essere regolata in altri momenti
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Rapporto tra struttura della cromatina e trascrizione
DNA + ISTONI= nucleosomi compattamento e de-compattamento della cromatina I geni trascritti si trovano in zone di cromatina decondensata
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Modificazioni più comuni
Acetilazione istoni Complessi rimodellatori della cromatina
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FOSFORILAZIONE METILAZIONE ACETILAZIONE CODICE ISTONICO
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Metilazione DNA La metilazione: C del 2-7% delle coppie CG
Favorisce lo stato eterocromatico Metilazione e imprinting genomico: l’espressione di alcuni geni è determinata dall’origine parentale
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Regolazione a livello post trascrizionale: i micro-RNA
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microRNA inibiscono traduzione mRNA
Molecole di RNA piccolissime: nucleotidi miRNA: presenti in tutti gli eucarioti, trascritti da RNApol II
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Meccanismo d’azione miRNA
Complementarietà imperfetta: blocco traduzione mRNA Complementarietà perfetta: degradazione mRNA
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Pri-miRNA è convertito in pre-miRNA da Drosha (RNAasi)
Pre-miRNA è esportato nel citoplasma
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DICER (endonucleasi) converte Pre-miRNA in RNA a doppio filamento
Uno dei 2 filamenti è il mi-RNA e viene incorporato nel complesso RISC Il mi-RNA riconosce un mRNA bersaglio e blocca la traduzione
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Il meccanismo dei miRNA è alla base dell’ interferenza da RNA indotta dai siRNA (Small interfering RNA) I siRNA hanno un ruolo importante in alcuni meccanismi antivirali o di modellamento della cromatina siRNA sintetici potrebbero avere applicazioni in ricerca e clinica
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RNA INDUCED SILENCING COMPLEX: RISC
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Molecole di siRNA derivano da lunghe molecole di RNA bicatenario prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula (virus) RNAi perciò rappresenta un sistema di difesa contro l’invasione di elementi genetici estranei e di conservazione della stabilità del genoma
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Degradazione RNA Gli introni sono degradati nel nucleo
Controllo qualità: eliminazione di molecole difettose di RNA miRNA e siRNA mRNA eucarioti sono degradati a velocità diverse, ulteriore meccanismo di controllo dell’espressione genica
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I fattori generici di trascrizione sono uguali per ogni polimerasi (es RNA pol II); le proteine che regolano i geni sono diverse per ciascun gene L’interazione tra molte proteine modula la trascrizione di ogni singolo gene
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