Laboratorio di Neurofarmacologia Molecolare

Presentazione sul tema: "Laboratorio di Neurofarmacologia Molecolare"— Transcript della presentazione:

1 Laboratorio di Neurofarmacologia Molecolare
Prof.ssa Patrizia Romualdi e Prof. Sanzio Candeletti Collaboratori Ricercatori Dr.ssa Lucia Carboni Assegnisti di ricerca Dr.ssa Francesca Caputi Dottorandi Dr.ssa Martina Palmisano Laureato frequentatore Dr.ssa Daria Mazza

2 Linee di ricerca: Ruolo di differenti sistemi endogeni peptidergici nella: dipendenza da sostanze d’abuso modulazione della trasmissione nocicettiva in modelli di dolore cronico neuropatico patologie del SNC quali Alzheimer, Parkinson Nel nostro laboratorio indaghiamo il ruolo di differenti sistemi endogeni peptidergici in diversi ambiti, in particolare nella dipendenza da sostanze da abuso, nella modulazione nocicettiva e in alcuna patologie neurodegenerative quali Alzheimer e Parkinson. Ci occupiamo quindi di ricerca sperimentale di tipo preclinico per cui utilizziamo modelli sia in vitro che in vivo. Ricerca Sperimentale Preclinica: in vitro ed in vivo

3 Farmacologia delle sostanze d’abuso
COCAINA 9-THC Farmacologia delle sostanze d’abuso Per quanto riguarda le sostanze d’abuso andiamo a valutare le alterazioni che esse causano a livello dei sistemi endogeni peptidergici. In particolare, da molti anni studiamo gli effetti di cocaina e oppiacei e ma da qualche anno ci occupiamo anche di cannabinoidi come il delta9thc ed amfetamine quali l’ecstasy. OPPIACEI ALCOOL MDMA (ECSTASY)

4 Sperimentazione in vitro ed in vivo
Trattamenti su colture cellulari Trattamenti acuti e cronici nel ratto/topo e prelievo delle aree cerebrali interessate Per quanto riguarda la sperimentazione in vitro,

5 TARGETS di ricerca: Alterazioni a livello dei meccanismi di trasduzione del segnale (Western Blotting) Alterazioni a livello dell’espressione genica (Real Time PCR) Meccanismi epigenetici di controllo dell’espressione genica Modelli di dolore neuropatico Alterazioni dei livelli dei neuropeptidi (RIA)

6 Meccanismi di trasduzione del segnale: WESTERN BLOTTING
METODO IMMUNOENZIMATICO SDS-PAGE ELECTRO-TRANSFER La tecnica di western blotting prevede una corsa elettroforetica delle proteine su un gel di SDS, il loro successivo trasferimento su una membrana di nitrocellulosa ed infine il rilevamento e la quantifica della proteina di interesse tramite un metodo immunoenzimatico. Mediante la tecnica di western blotting possiamo ad esempio indagare l’attivazione ovvero la fosforilazione di un fattore di trascrizione come CREB. Banda di CREB

7 Esempio di immuno-blot con relativa quantifica tramite analisi
statistica dei livelli di proteina fosfo-CREB Questa è l’immagine di una membrana dove potete vedere che la quantità di proteina nel nostro trattato è maggiore rispetto al controllo; nella figura b i livelli di proteina sono stati analizzati ed infine espressi in un istogramma

8 Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione
Real Time PCR Fluorescenza Un’altra tecnica utilizzata nel nostro laboratorio è la Real Time PCR; questa tecnica di amplificazione del DNA serve a quantificare l’espressione genica rilevabile grazie a un colorante fluorescente che si intercala alla doppia elica di DNA. Cicli di amplificazione Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione il cui CT(=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di template iniziale

9 Esempio di analisi quantitativa tramite PCR dei geni di interesse
in un modello di dolore neuropatico Questo è un esempio dei livelli di espressione genica di alcuni geni di interesse in un modello in vivo di dolore neuropatico. Sham= falsamente operati CCI 7days= operati e sacrificati al giorno 7 CCI 14days= operati e sacrificati al giorno 14

10 Meccanismi epigenetici nella regolazione dell’espressione genica
ORGANIZZAZIONE della CROMATINA Regolazione della trascrizione Un altro aspetto della nostra ricerca sia in vivo che in vitro riguarda i meccanismi epigenetici che regolano l’espressione genica; le due principali modifiche epigenetiche sono la metilazione del DNA e le modificazioni istoniche. La metilazione del DNA nelle cellule eucariotiche è a carico della C; in genere il bersaglio della metilazione è la C della sequenza dinucleotidica CG (le cosiddette CpG island). Invece le modificazioni istoniche sono responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina e possono essere ad esempio acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni. La modificazione della coda degli istoni può agire da segnale per proteine che controllano l’espressione o la replicazione di regioni cromosomiche.

11 Esposizione a sostanze d’abuso
L'immunoprecipitazione della Cromatina (ChIP) è un metodo ampiamente usato per identificare specifiche proteine connesse a una regione del genoma. Queste proteine possono essere ad esempio istoni modificati ad un amminoacido particolare; utilizzando anticorpi che riconoscono la modifica dell'istone, possiamo infatti quantificare l’entità della modifica. La ChIP è una tecnica che prevede un fissaggio iniziale con formaldeide affinché avvenga il crosslink tra DNA e proteine; la cromatina viene poi frammentata tramite sonicazione e sottoposta a immunoselezione grazie a specifici anticorpi; in questo modo tutte le sequenze del DNA unite con crosslink alla proteina di interesse coprecipiteranno. A questo punto il crosslink viene revertito e, dopo purificazione del DNA, si effettua una PCR per identificare la regione del promotore del gene di interesse associato alla modifica istonica.

12 statistica a seguito di immuno-precipitazione con
Esempio di analisi statistica a seguito di immuno-precipitazione con l’anticorpo H3K4 tri-metilato In questo esempio siamo andati ad analizzare il promotore del gene della prodinorfina, in particolare abbiamo voluto vedere la trimetilazione della lisina 4 sull’istone 3 in seguito a un trattamento con etanolo e a diversi tempi di esposizione.

13 DOLORE CRONICO/NEUROPATICO
MODELLO ANIMALE: Chronic Constriction Injury (CCI) Oltre alle sostanze d’abuso, una delle nostre linee di ricerca riguarda il dolore neuropatico; come modello sperimentale utilizziamo un modello in vivo validato definito CCI in cui l’animale subisce una lesione parziale ad un nervo in modo che nei giorni successivi sviluppi dolore.

14 MODULAZIONE DELLA TRASMISSIONE NOCICETTIVA
Test analgesimetrici VON FREY TEST HOT/COLD PLATE Soglia nocicettiva TAIL FLICK PLANTAR TEST Per verificare che effettivamente l’animale abbia sviluppato dolore si effettuano dei test comportamentali analgesimetrici che rilavano la soglia nocicettiva dell’animale.

15 PURIFICAZIONE E DOSAGGIO RADIO-IMMUNOLOGICO
Colonnine Sep-Pak C18 Interpolazione dei dati sulla curva di taratura I campioni raccolti vengono poi purificati su colonnine, liofilizzati e quantificati tramite dosaggio radioimmunologico. Questo test si basa sull’interazione tra antigene, rappresentato dal neuropeptide di interesse, e anticorpo, e sulla competizione tra l’antigene marcato radioattivamente e quello da rivelare. Il complesso Ag-Ac viene poi separato e contato; interpolando i dati ottenuti su un’opportuna curva di taratura si ottiene la concentrazione del neuropeptide di interesse. < radioattività (in cpm) > ir-N/OF 15

16 PERFUSIONE SPINALE FRAZIONAMENTO DI CELLULE DEL SANGUE
Inoltre abbiamo messo a punto un modello sperimentale di perfusione spinale nel ratto che ci permette di determinare i livelli di alcuni neuropeptidi implicati nella trasmissione del dolore nel liquido cerebrospinale. In breve utilizziamo una pompa peristaltica multicanale, collegata a due cateteri. Il primo catetere preleva da un’estremità liquido cerebrospinale artificiale mantenuto a 37 gradi e dall’altra entra nell’animale attraversando la spina dorsale fino a raggiungere l’allargamento lombare. Da qui, il liquido perfonde e risale lungo il midollo; un secondo catetere preleva il liquido cerebrospinale che viene aliquotato e mantenuto in ghiaccio. FRAZIONAMENTO DI CELLULE DEL SANGUE 16

17 REQUISITI necessari per iniziare l’anno di internato:
numero massimo di esami rimanenti 4 tirocinio iniziato o quasi concluso lavoro con animali da esperimento DURATA DELL’INTERNATO: 1 ANNO CON FREQUENZA GIORNALIERA LISTE DISPONIBILI PRESSO I DOCENTI RESPONSABILI DEL LABORATORIO (prendere contatti prima possibile)