Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

Presentazione sul tema: "Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico"— Transcript della presentazione:

1 Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico
Metti il DNA e le cellule insieme Fai qualcosa di speciale Scatola nera Poi succede qualcosa …….

2 Trasformazione batterica Uptake of DNA nudo, spesso un plasmide circolare
Cell wall GFP Bacterial chromosomal DNA Beta lactamase (ampicillin resistance) pGLO plasmids

3 Metodi di trasformazione
Elettroporazione shock elettrico che rende le membrane cellulari permeabili al DNA(si usa anche per le lellule eucariotiche) Calcio cloruro/Heat Shock Cellule, rese competenti chimicamente, incorporano DNA nudo dopo heat shock

4 Ruolo del CaCl2 per rendere le cellule competenti
CaCl2 genera buchi nella membrana dei batteri rendendoli capaci di incorporare DNA

5 Ruolo del CaCl2 per rendere le cellule competenti- cont
CH2 P Base OH Sugar Gli ioni of Ca+2 carichi positivamente mascherano le cariche negative dei gruppi fosfato presenti nel DNA

6 Attenzione!!!! CaCl2 rende le cellule più fragili
Delicatezza (ghiaccio e pipettata gentile)

7 Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico
Metti il DNA e le cellule insieme 45 minuti in ghiaccio Il DNA aderisce ai batteri Shock termico 42 °C per 2 min Il DNA entra nei batteri

8 Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico - cont
Periodo di recupero a 37 °C in presenza di terreno che permette la replicazione del DNA plasmidico nelle cellule in cui è entrato 1 ora a 37 °C Questo periodo permette alle cellule di esprimere il gene di resistenza all’ antibiotico (ampicillina) e di potere replicare successivamente sulle piastre

9 Controlli della Trasformazione

10 Spread plate

11 Spread plate

12 Spread plate Piastre rigorosamente asciutte
MAI piastrare più di 300 µl o MENO di 50 µl Raffreddare bene la bacchetta di vetro Lasciare asciugare prima di spostare le piastre Le piastre danno conteggi affidabili solo se il numero di colonie é tra 30 e 500

13 Finalmente…. Se non avete la disponibilità di un incubatore a 37 °C potete lasciare le piastre sul banco. Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.

14 EFFICIENZA DI TRASFORMAZIONE Colony Forming Unit (CFU)/µg DNA
Calcolre i µg totali di DNA usati Calcolare il fattore di diluizione della piastratura (se é stata fatta) Contare le colonie Moltiplicare il numero di colonie per la diluizione di piastratura Dividere per i ng di DNA utilizzato Efficienza di trasformazione (CFU/g)= n°colonie  g DNA