Compattamento del DNA nei cromosomi

Presentazione sul tema: "Compattamento del DNA nei cromosomi"— Transcript della presentazione:

1 Compattamento del DNA nei cromosomi
Il DNA cellulare e virale è associato a proteine in complessi detti cromosomi. Il compattamento è essenziale per vari motivi: contenimento nel ristretto spazio cellulare (o virale) protezione da possibili danni maggiore stabilità per una corretta espressione dell’informazione efficiente trasmissione alle cellule figlie organizzazione strutturale di ordine superiore, che facilita l’espressione genica e la ricombinazione omologa, che genera la diversità individuale. Cromosoma eucariotico: metà DNA e metà proteine, la > parte sono istoni (cromatina). Le proteine non istoniche regolano replicazione, trascrizione, riparo, ricombinazione. Le proteine della cromatina possono compattare DNA  volte (da cm a m). Compattamento avviene in stadi successivi: 1) associazione DNA-istoni => nucleosomi, 2) associazione fra nucleosomi vicini, e così via. Compattamento => < accessibilità per le proteine => < metabolismo del DNA. La competizione spazio-temporale fra compattamento e accesso di proteine a diverse regioni del cromosoma è alla base della regolazione dell’espressione genica, che in ultima analisi dipende da modificazioni enzimatiche ± reversibili dei nucleosomi. Il compattamento del DNA nei procarioti è mediata da proteine istone-simili, che non formano nucleosomi, ma il processo è ancora poco chiaro. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

2 Variabilità dei cromosomi
La > parte dei procarioti ha un solo cromosoma lineare, esistono però delle eccezioni: alcuni hanno più cromosomi lineari o una combinazione lineari-circolari. Tutti gli eucarioti invece hanno da 2 a 50 cromosomi lineari (il macronucleo di Tethahymena può arrivare a più di mille). Entrambi i tipi pongono dei problemi di replicazione: i circolari devono essere separati (topoisomerasi), i lineari devono essere protetti alle estremità dall’azione delle DNAsi e richiedono una speciale attività enzimatica per la ricopiatura (telomerasi). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

3 Confronto fra cellula eucariotica e procariotica
I procarioti hanno una copia unica del/dei cromosoma/i, organizzata in una struttura detta nucleoide. Spesso contengono una o più molecole di DNA piccole e circolari, dette plasmidi, che portano geni non essenziali. La > parte delle cellule eucariotiche è diploide (coppie di cromosomi omologhi, ognuno da un genitore, nel nucleo). Le cellule coinvolte nella riproduzione sessuale (gameti) sono aploidi (una sola copia di ciascun cromosoma), altre sono poliploidi (più copie, fino a migliaia). Questa amplificazione genica permette una maggiore sintesi di RNA e proteine I megacariociti ad es. hanno in media 128 copie di ciascun cromosoma, producono migliaia di piastrine, prive di cromosomi, componenti essenziali del sangue (fino a /ml). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

4 La densità genica diminuisce al crescere della complessità dell’organismo
La > parte del cromosoma di E.coli è formata da geni, mentre la > parte delle regioni non codificanti è adibita alla regolazione trascrizionale dei geni, a parte l’origine della replicazione, comunque molto corta. La figura rappresenta una porzione di 65 Kb attorno al gene della subunità maggiore della RNA polimerasi di vari organismi fa vedere la correlazione inversa fra lunghezza e numero di geni all’aumentare della complessità degli organismi stessi. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

5 La grandezza del genoma è correlata alla complessità dell’organismo
L’assetto aploide del genoma varia molto nei vari organismi. I procarioti, essendo più semplici, hanno un genoma più piccolo (< 10 Megabasi). Un eucariote monocellulare può arrivare a 50 Mb, organismi multicellulari fino a 100 Gb. Buona correlazione fra complessità e dimensione genomica, ma vi sono organismi di complessità simile con dimensione genomica molto diversa. Es. la Drosofila ha un genoma 25 volte < della locusta, il genoma del riso è 40 volte < del grano. In questi casi non è è il genoma in toto ma il numero di geni ad essere correlato alla complessità. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

6 Densità genica E’ data dal numero geni per Mb. Nei batteri può arrivare a 1000, negli eucarioti è < e molto variabile (500 nei funghi, < 10 nei vertebrati). La massima densità genica si ha nei virus (geni sovrapposti). Fattori che contribuiscono alla < densità genica degli eucarioti: > dimensioni geniche e > sequenze intergeniche. I geni sono più lunghi per due ragioni: > quantità di sequenze regolative della trascrizione e di regioni intrageniche non codificanti (introni) rispetto a quelle codificanti (esoni). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

7 Splicing dell’RNA La dimensione media di un gene umano è 27 kb, mentre la dimensione media della sequenza codificante è solo 1.3 kb (5% esoni, 95% introni). Nel lievito invece solo il 3.5% dei geni contiene introni e nessuno di questi è > di 1 kb. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

8 Organizzazione e contenuto del genoma umano
La > parte del DNA non codifica proteine (>60%) e ha funzione sconosciuta. Due tipi di DNA intergenico: sequenze uniche (1/4) e sequenze ripetute (3/4). Le sequenze uniche, apparentemente non funzionali, includono geni mutati, frammenti genici e pseudogeni. Quasi la metà del genoma umano è composto da sequenze ripetute, divise in due classi: microsatelliti (<13 basi ripetute in tandem, spesso 2 basi, es. CACACACACACACA, 3% del genoma) e altamente ripetute (>100 basi, fino a > 1 kb), presenti come copie singole disperse nel genoma o raggruppate in cluster. La > parte di queste sono elementi trasponibili, sequenze possono spostarsi nel genoma replicandosi, lasciando la copia originale nella posizione preesistente. Pur essendo un evento raro, la trasposizione è aumentato nel tempo (oggi i trasposoni sono il 45% del genoma), ma il loro spostamento è controllato in modo da prevenire danni al cromosoma. Elementi trasponibili e microsatelliti, anche se in misura molto <, sono presenti anche nei batteri e nel lievito. Il mantenimento del DNA ripetuto lascia supporre che conferisca un vantaggio selettivo per l’organismo. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

9 Formazione degli pseudogeni
Sono prodotti dalla trascrittasi inversa, un enzima virale che, se presente nella cellula, può ricopiare l’mRNA in DNA (cDNA), che a sua volta può essere inserito nel genoma. La mancata espressione del cDNA dopo integrazione nel genoma dipende dalla mancanza di sequenze regolative. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

10 Duplicazione e segregazione dei cromosomi
I cromosomi eucariotici hanno bisogno dei seguenti elementi non genici, non coinvolti nella regolazione genica, per una corretta replicazione e segregazione: - Origini di replicazione: siti d’assemblaggio dei complessi di replicazione (eucarioti: una origine ogni kb; procarioti: una sola origine per cromosoma) - Centromeri: siti di assemblaggio del cinetocoro, complesso proteico responsabile della segregazione dei cromosomi replicati (uno per cromosoma) - Telomeri: complessi proteici localizzati alle estremità dei cromosomi, proteggono da ricombinazione e degradazione. La telomerasi completa la replicazione dei terminali. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

11 Centromeri, telomeri e origini di replicazione
Elementi essenziali per mantenimento cromosomi eucariotici. Un centromero per cromosoma in posizione interna, due telomeri alle estremità, più origini di replicazione ogni circa 30 kb. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

12 Assenza (o presenza di più) di un centromero porta a perdita (o rottura) del cromosoma
ogni cromosoma normale ha un solo centromero, che porta alla formazione del cinetocoro. Il cinetocoro di ciascun cromosoma si lega ai microtubuli e migra ai poli opposti del fuso mitotico cromosomi senza cinetocoro vengono perduti rapidamente perché non si attaccano al fuso e segregano a caso cromosomi con  2 centromeri possono rompersi durante la segregazione, legandosi contemporaneamente ai poli opposti del fuso mitotico. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

13 Grandezza e composizione dei centromeri
Varia molto nei diversi organismi: nel lievito S.cerevisiae sono corti (< 200 bp) e privi di sequenze non ripetute, in altri organismi, fra cui un diverso lievito, S. pombe, sono lunghi (> 40 kb) e formati da sequenze ripetute. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

14 Struttura tipo di un telomero
Corte sequenze ripetute ricche in TG formano i telomeri. L’estremità 3’ a singolo filamento può essere lunga anche centinaia di basi. In figura la sequenza del telomero umano. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

15 Ciclo mitotico delle cellule eucariotiche
Mentre nei batteri duplicazione e segregazione del cromosoma sono contemporanee, negli eucarioti avvengono in fasi diverse del ciclo cellulare, che è composto da 4 fasi G1 (gap1), S (sintesi del DNA), G2 (gap2) ed M (mitosi). FASE S: prima di entrare in fase S, la cellula deve raggiungere certe dimensioni. FASI G1 e G2: in G1 vi sono vari punti di controllo, dove il ciclo si arresta se le proteine e i nutrienti sono insufficienti. Anche quando il DNA subisce dei danni, il ciclo si arresta in G1 o in G2, per permettere la riparazione del danno. FASE M: in cui si hanno segregazione e divisione cellulare. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

16 Eventi chiave della fase S
La replicazione porta alla formazione di due copie di ciascun cromosoma. Subito dopo la replicazione, le regioni omologhe dei cromatidi fratelli vengono tenute assieme da anelli di coesina fino al momento della segregazione. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

17 Eventi della mitosi I cromatidi fratelli si legano, mediante i loro cinetocori, a lati opposti del fuso mitotico, composto da microtubuli attaccati ai rispettivi centri di organizzazione dei microtubuli (centrosomi negli animali, corpi polari nei lieviti e funghi). La loro segregazione avviene dopo la distruzione della coesina, per trascinamento verso i poli mediato dai microtubuli. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

18 Cambiamenti nella struttura dei cromosomi
I cromosomi si condensano al massimo in fase M (condensazione cromosomica) per facilitare la loro separazione. Nelle restanti fasi del ciclo (interfase) sono meno compatti e aggrovigliati come spaghetti, con cambiamenti vari: coesione dei cromatidi fratelli dopo la replicazione, attivazione e repressione della trascrizione di singoli geni durante tutta l’interfase. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

19 Mantenimento della struttura del cromosoma (SMC)
Proteine SMC e non SMC formano estesi complessi multiproteici che si legano alla doppia elica. Il complesso della coesina, formato da 2 proteine SMC + 1 non SMC, ha struttura circolare per unire i cromatidi fratelli. La condensazione del cromosoma richiede anche la condensina, simile alla coesina, pure con struttura circolare. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

20 Fasi della mitosi Profase: i cromosomi si assemblano in forma compatta, necessaria per la segregazione. Alla fine della profase la membrana nucleare viene dissolta e la cellula entra in metafase. Metafase: si forma il fuso mitotico e i cinetocori dei cromatidi fratelli si attaccano ai microtubuli. La trazione di un aggancio bivalente, che si oppone alla coesione della coppia dei cromatidi, porta all’allineamento di tutti i cromosomi nella zona mediana della cellula (piastra metafasica). Anafase: la degradazione della coesina porta alla separazione dei cromatidi fratelli e alla migrazione verso i poli opposti. Telofase: si riforma la membrana nucleare attorno a ciascun set di cromosomi segregati. La divisione cellulare viene completata separando il citoplasma delle due cellule in formazione (citochinesi). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

21 Fasi della meiosi La meiosi dimezza il numero di cromosomi parentali. Anche il ciclo meiotico include una fase G1, una fase S ed una fase G2 più lunga. Durante l’interfase i cromosomi vengono duplicati e cromatidi fratelli restano associati, come nella mitosi. Le coppie di cromosomi omologhi si appaiano fra loro e si ricombinano. Nella meiosi abbiamo due cicli di segregazione (meiosi I e II), ognuno composto da profase metafase e anafase. Durante la metafase I gli omologhi si attaccano ai poli opposti mediante i loro cinetocori. L’aggancio è in questo caso monovalente perché entrambi i cinetocori di ogni omologo si attaccano allo stesso polo (a differenza della mitosi). In anafase I gli omologhi vengono separati e ognuno migra verso poli opposti. La meiosi II è molto simile alla mitosi, a parte la mancanza della fase S. Alla fine i cromosomi vengono separati originando 4 cellule nucleate con set aploide (una sola copia di ciascun cromosoma). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

22 Diverse forme strutturali della cromatina
I cromosomi in fase M assumono strutture molto compatte, mentre in interfase sono poco avvolte (fibra 10nm e fibra 30nm). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

23 Il nucleosoma Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

24 Impacchettamento del DNA eucarotico nei nucleosomi
Il nucleosoma è composto da un nucleo di 8 proteine istoniche attorno a cui è avvolto il DNA. Il DNA fra due nucleosomi è detto DNA linker. Il DNA viene compattato ~ 6 volte nei nucleosomi (I stadio del compattamento). Il DNA associato ai nucleosomi (DNA core) è avvolto ~ 1.7 volte attorno all’ottamero (147 bp in tutte le cellule eucariotiche). Il DNA linker invece è variabile (20-60 bp), con una lunghezza tipica per ogni organismo, che si riflette in una diversità di strutture di ordine superiore della cromatina. Le zone di DNA non organizzate in nucleosomi sono impegnate nell’espressione genica, replicazione o ricombinazione. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

25 Gli istoni Sono le proteine più abbondanti associate al DNA eucariotico. Sono di 5 tipi: H2A, H2B, H3, H4 (formano il core) e H1 (lega il DNA linker fra 2 nucleosomi). I primi 4 sono presenti in quantità uguali nella cellula, mentre H1 è metà (1 nucleosoma). Gli istoni sono proteine basiche, cioè cariche positivamente (> 20% di lisina e arginina), di pm KDa (H1 è 20 kDa). Il core si assembla solo in presenza di DNA, mentre da soli in soluzione formano complessi intermedi. Sono formati da un dominio ben conservato, detto histone-fold, formato da 3 -eliche, coinvolte nella formazione di dimeri H2A-H2B e H3-H4, questi ultimi poi formano tetrameri. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

26 Assemblaggio di un nucleosoma
Al DNA si lega prima un tetramero (H3-H4)2 e poi due dimeri H2A-H2B. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

27 Accessibilità delle code N-terminali degli istoni core alle proteasi
Per trattamento con tripsina le code vengono digerite, mentre il core resta intatto, quindi non necessarie per l’assemblaggio del nucleosoma. Sono però sede di molte modificazioni enzimatiche, che fanno cambiare funzione al nucleosoma (fosfoforilazioni, acetilazioni e metilazioni di residui di lisina e serina). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

28 Struttura dettagliata del nucleosoma
Il nucleosoma possiede un asse di simmetria binario. Ciascuno dimero del tetramero H3-H4 è situato nella parte superiore e lega 30 bp nella zona centrale ed uno dei due terminali delle 147 bp del DNA, mentre i dimeri H2-H3 sono situati nella parte inferiore del cilindretto. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

29 Nucleosoma privo di dimeri H2A-H2B
L’interazione col tetramero H3-H4 è responsabile della curvatura del DNA, facilitando l’associazione coi dimeri H2A-H2B. Non vale il viceversa. La più debole interazione dei dimeri HA-H2B col DNA rende più facile il loro distacco, aumentando l’accessibilità della RNA polimerasi durante la trascrizione. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

30 Interazioni fra core istonico e DNA
In figura sono mostrati solo le interazioni fra un dimero H3-H4 e DNA. Vi sono 14 siti di contatto fra DNA e istoni, pari al numero di volte che il solco minore si rivolge verso l’interno del core. L’associazione, mediata da 140 legami a H (la > parte fra residui proteici (+) e atomi di O (-) dello scheletro fosfodiesterico, solo 7 direttamente con le basi nel solco minore, fornisce l’energia necessaria alla curvatura del DNA. Nessuno di questi legami è sequenza-specifico. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

31 Le code degli istoni sporgono da posizioni specifiche
Le code di H3 e H2B passano fra due regioni di doppia elica, quelle di H4 e H2A fuoriescono sopra e sotto alla doppia elica. Le porzioni di ciascuna coda più vicine al core sono poco sensibili alle proteasi e formano alcuni legami a H col DNA. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

32 Strutture di ordine superiore della cromatina
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33 Interazione dell’istone H1 col DNA nucleosomico
Il passaggio successivo dell’impacchettamento dei nucleosomi è mediato dall’istone H1, che interagisce sia con una porzione centrale del DNA core che con ~20 bp di uno dei due DNA linker, facendo aumentare la lunghezza di DNA arrotolato. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

34 La presenza di H1 fa aumentare la quantità di DNA avvolto attorno al core istonico
Il ripiegamento del DNA linker, provocato dall’istone H1, di circa 20° rispetto all’asse diade del nucleosoma, favorisce la formazione di una struttura a zig-zag della cromatina, aumentando l’impacchettamento del DNA. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

35 Effetto di H1 sull’impacchettamento dei nucleosomi al ME
A) Assenza di H1; B) presenza di H1. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

36 Modelli di formazione della fibra da 30 nm
In vitro ad alta conc. salina si forma una fibra di diametro 30 nm, che riduce notevolmente l’accessibilità del DNA. La fibra 30 nm è spiegabile in base a due modelli: a) modello solenoidale: 6 nucleosomi/giro, con un buco centrale di 11 nm (visto ai raggi X e in ME) e le superfici superiore e inferiore di ciascun nucleosoma adiacenti. Il DNA linker è parte della superelica e non attraversa mai l’asse del solenoide. b) modello a zig-zag: differisce dal precedente per la diversa posizione del DNA linker, che attraversa l’asse longitudinale della fibra. E’ favorito dalla presenza di DNA linker più lunghi, variabili da specie a specie. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

37 Le code degli istoni intervengono nella formazione della fibra 30 nm
Istoni del core, privati di coda N-terminale, sono incapaci di formare la fibra 30 nm. Nel cristallo sono state osservate legami a H fra la coda di H4 e parti di H2A-H2B di nucleosomi vicini ben conservate in tutti gli eucarioti, ma non coinvolte col legame al DNA e nella formazione dell’ottamero. E’ probabile che le code, in quanto frequentemente modificate nella cellula, influenzino la formazione della fibra da 30 nm e di altre strutture d’ordine superiore. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

38 Strutture di ordine superiore della cromatina
La fibra 30 nm compatta il DNA di ~ 40 volte. Questo ulteriore impacchettamento prevede la formazione di anse di kb, bloccate alla base da una struttura proteica detta “impalcatura nucleare”, di cui fanno parte 2 classi di proteine: le topoisomerasi II, che probabilmente bloccano le anse alla base; le proteine SMC (per il mantenimento strutturale del cromosoma), che abbiamo già visto come componenti chiave del meccanismo di condensazione post-replicativa dei cromosomi. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

39 Alterazioni della struttura della cromatina indotte da modificazioni istoniche
Gli istoni sono fra le proteine meglio conservate, per cui i nucleosomi sono molto simili in tutti gli eucarioti. Tuttavia esistono alcune varianti istoniche, che permettono la formazione di nucleosomi alternativi, per caratterizzare regioni particolari o per conferire funzioni specializzate ai nucleosomi. Esempi: H2A.z è abbondante in regioni attivamente trascritte, impedendo la formazione di strutture cromatiniche repressive. CENP-A sostituisce H3 nei nucleosomi del cinetocoro (DNA centromerico), mediando con la sua lunga coda l’attacco al fuso. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

40 Regolazione della struttura della cromatina
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41 Natura dinamica dell’associazione DNA – istoni
L’accessibilità del DNA nei nucleosomi cambia con le diverse esigenze della cellula, data la natura non covalente delle interazioni fra istoni e DNA. Uno srotolamento più o meno rilevante del DNA, senza distacco, può liberare siti di legame specifici per certe proteine. In generale, più i siti sono interni al nucleosoma, meno sono accessibili. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

42 Complessi di rimodellamento nucleosomico
Molti complessi proteici influenzano il posizionamento dei nucleosomi e le interazioni DNA-istoni, per idrolisi di ATP, tramite: scivolamento dell’ottamero sul DNA trasferimento da un tratto di DNA ad un altro rimodellamento del nucleosoma, tale da permettere un maggior accesso al DNA. Esistono molti tipi di complessi di rimodellamento nei diversi tessuti. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

43 IL posizionamento dei nucleosomi può dipendere da proteine che legano il DNA
Se due proteine si legano sul DNA a distanza < 150 bp, non si può formare un nucleosoma intermedio Se alcune proteine legano fortemente il nucleosoma, lo posizionano preferenzialmente nelle loro vicinanze. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

44 I nucleosomi si formano in modo preferenziale sul DNA ricurvo
Sequenze di DNA ricche in AT, che ripiegano il DNA dalla parte del solco <, favoriscono il posizionamento del nucleosoma. Viceversa, sequenze ricche in GC, avendo tendenza inversa, posizionano il solco < esternamente. Tratti di 5 AT + 5 CG sono siti di posizionamento preferenziale del nucleosoma, anche se non richiesti per l’assemblaggio. Il posizionamento può avere sia un effetto positivo che negativo sull’accessibilità di siti specifici del DNA. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

45 Modificazioni degl istoni alterano la funzione della cromatina
Istoni isolati dalle cellule risultano fortemente modificati nella zona N-terminale: acetile o metile su lisina, fosfato su serina. Acetilazione associata con attivazione della trascrizione, deacetilazione con repressione, metilazione con entrambe (dipende dalla posizione dell’amminoacido modificato). Fosforilazione di H3 in cromatina altamente condensata (cromosomi mitotici). Acetilazione e fosforilazione riducono la carica positiva netta degli istoni, quindi l’affinità per il DNA. Si pensa che esista un codice di riconoscimento delle modifiche da parte delle proteine non istoniche (V. schema per H3, H4). Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

46 Effetti indotti dalla modificazione degli istoni
sull’associazione DNA-istoni: code non modificate e metilate legano il DNA più fortemente di quelle acetilate code modificate legano complessi di rimodellamento della cromatina, alterando strutture di ordine superiore. Specifici domini mediano queste interazioni: bromodomini su code acetilate, cromodomini su code metilate. Alcune proteine, contenenti il bromodominio, regolano la trascrizione o la formazione dell’eterocromatina: ad es. il fattore TFIID dirige il complesso responsabile della trascrizione sui nucleosomi acetilati, aumentando l’attività trascrizionale. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

47 Complessi di rimodellamento e enzimi che modificano gli istoni agiscono di concerto sulla cromatina
Proteine specifiche reclutano gli enzimi responsabili delle modificazioni istoniche. Acetilasi, deacetilasi e metilasi istoniche, che fanno parte di complessi multiproteici, agiscono su particolari residui istonici. Il reclutamento di questi enzimi su particolari regioni del DNA, indotta da queste proteine non istoniche, è responsabile del posizionamento dei nucleosomi sulla cromatina e modulazione dell’espressione genica, modificando l’accessibilità del DNA. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

48 Assemblaggio dei nucleosomi dopo la replicazione
La replicazione del DNA richiede un parziale disassemblaggio dei nucleosomi in tetrameri H3-H4 e dimeri H2A-H2B, ma il DNA viene rapidamente riorganizzato in cromatina per riassociazione del tetramero H3-H4, dei dimeri H2A-H2B e di H1. Metà dei nucleosomi sui cromatidi fratelli deve necessariamente essere di neosintesi, mentre i vecchi istoni si ridistribuiscono su entrambi i cromosomi: il tetramero H3-H4 resta legato a caso ad una delle due nuove doppie eliche, mentre i dimeri H2A-H2B rilasciati entrano a far parte del pool cellullare dei dimeri H2A-H2B, per poi riassociarsi a caso. Ciò permette di propagare le modifiche istoniche parentali e di posizionare i vecchi istoni in zone simili a quelle nel cromosoma parentale. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

49 Trasmissione dello stato parentale della cromatina è favorito da ridistribuzione casuale dei tetrameri H3-H4 Le modifiche parentali, trasmesse ai cromosomi fratelli durante la replicazione, favoriscono il reclutamento di enzimi modificanti e quindi la propagazione dello stesso stato su due nuovi cromosomi. L’esempio considera l’acetilazione. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005

50 Assemblaggio dei nucleosomi
Non è un processo spontaneo bensì richiede l’intervento di proteine trasportatrici di istoni, cariche negativamente, che prima legano i tetrameri H3-H4 liberi (CAF-I) e i dimeri H2A-H2B liberi (NAP-I) e poi li trasportano sul DNA. CAF-I è reclutato sul DNA per interazione con la proteina PCNA a forma di anello, che avvolge il DNA e trattiene la DNA polimerasi sullo stampo durante la replicazione, poi rilasciata dopo la sintesi. Watson et al., BIOLOGIA MOLECOLARE DEL GENE, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2005