Leucemie acute e PCR: diagnostica e valutazione della malattia residua D.ssa Sabrina Coluzzi Dipartimento Clinico Assistenziale Oncologico Unità Operativa.

Presentazione sul tema: "Leucemie acute e PCR: diagnostica e valutazione della malattia residua D.ssa Sabrina Coluzzi Dipartimento Clinico Assistenziale Oncologico Unità Operativa."— Transcript della presentazione:

1 Leucemie acute e PCR: diagnostica e valutazione della malattia residua D.ssa Sabrina Coluzzi Dipartimento Clinico Assistenziale Oncologico Unità Operativa di Ematologia Centro Trapianto di Cellule Staminali

2 L’ematopoiesi

3 Leucemie acute Le leucemie derivano da alterazioni molecolari presenti a livello di un precursore ematopoietico

4 “Leukemic Stem Cell” La popolazione leucemica è eterogenea: solo una piccola percentuale di queste cellule ha capacità di autorinnovamento e mostra una multidrug resistance Queste caratteristiche spiegano l’importanza di tecniche (come la PCR) volte alla individuazione di eventuali cellule leucemiche residue dopo l’ottenimento di una risposta apparentemente completa

5 Percorso diagnostico Emocromo Morfologia delle cellule Esami citochimici Esami citofluorimetrici Indagini citogenetiche Indagini molecolari

6 Classificazione leucemie (WHO) 1.LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI - LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBFα)/ETO - Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RARα] - LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBFβ/MYH11X] - LMA con anomalie 11q23 2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE - Secondaria a sindrome mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie mieloproliferative - De novo 3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA - Secondaria ad agenti alchilanti - Secondaria a epipodofillotossine - Alti tipi 4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA - LMA con differenziazione minima - LMA senza maturazione - LMA con maturazione - Leucemia mielomonocitica acuta - Leucemia monocitica acuta - Leucemia eritroide acuta - Leucemia megacariocitica acuta - Leucemia basofila acuta - Panmielosi acuta con mielofibrosi - Sarcoma mieloide (granulocitico)

7 Traslocazioni citogenetiche ricorrenti Rappresentano il 15-20% delle LAM Sono alterazioni del “core binding factor”, complesso proteico essenziale per l’ematopoiesi, che normalmente attiva una istone acetiltrasfrasi e la trascrizione di fattori di differenziamento Il complesso, se mutato, attiva una istone deacetilasi e quindi si ha blocco trascrizionale e blocco differenzitivo Hanno prognosi favorevole

8 Rilevamento trascritti di fusione Estrazione RNA Retrotrascrizio ne Amplificazione Corsa su gel di agarosio 2% Osservazone agli UV

9 Monitoraggio mediante RQ-PCR Il livello di espressione del trascritto è quantizzato in Real Time Numero Copie trascritto/Numero Copie ABL x 10 4 Una riduzione al follow-up di tre logaritmi è considerata remissione

10 Follow up AML1 ETO

11 Classificazione leucemie (WHO) 1.LMA CON TRASLOCAZIONI GITOGENETICHE RICORRENTI - LMA con t(8;21)(q22;22), AML1(CBFα)/ETO - Leucemia Promielocitica Acuta [LMA con t(15;17)(q22;q11-12) e varianti PML/RARα] - LMA con ipereosinofilia midollare [inv(16)(p13;q22) o t(16;16)(p13;q11), CBFβ/MYH11X] - LMA con anomalie 11q23 2. LMA CON DISPLASIA MULTILINEARE - Secondaria a sindrome mielodisplastica o sindromi mielodisplastiche/malattie mieloproliferative - De novo 3. LMA E SINDROMI MIELODISPLASTICHE SECONDARIE A CHEMIOTERAPIA - Secondaria ad agenti alchilanti - Secondaria a epipodofillotossine - Alti tipi 4. LMA NON ALTRIMENTI CLASSIFICATA - LMA con differenziazione minima - LMA senza maturazione - LMA con maturazione - Leucemia mielomonocitica acuta - Leucemia monocitica acuta - Leucemia eritroide acuta - Leucemia megacariocitica acuta - Leucemia basofila acuta - Panmielosi acuta con mielofibrosi - Sarcoma mieloide (granulocitico)

12 Difficoltà diagnostiche Tuttavia, solo nel 50% dei casi si riscontrano alterazioni genetiche, utili per indirizzare il clinico verso un sottotipo neoplastico piuttosto che un altro Nei rimanenti casi la diagnosi si deve attualmente avvalere delle tecniche precedentemente accennate

13 Nuovi marker molecolari Sono in corso studi multicentrici per individuare nuovi markers molecolari L’attenzione si è focalizzata principalmente su: - FLT3 (fms-like tyrosine kinase) - WT1 (Wilms tumor 1)

14 FLT3 Recettore tirosin-chinasi presente sulla superficie dei progenitori ematopoietici Fondamentale per sopravvivenza e differenziazione delle cellule

15 Pathway di FLT3

16 Genetica di FLT3 Nel 30% dei casi di LAM si osserva mutazione di FLT3 ITD, associata a leucocitosi ed alto numero di blasti. Tale mutazione consiste in una ripetizione da 3 a 400 nucleotidi nel dominio iuxtamembrana di FLT3 Exon 14 Exon 15 Intron Abnormal Normal ITD

17

18 Rilevamento FLT3-ITD Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sugli esoni 14 e 15 Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio Visualizzazione agli UV

19 FLT3-ITD 32% 34% 31%

20 Impatto di FLT3-ITD RISCHIO DI RICADUTA ITD +ITD - Citogenetica favorevole 37%29% Citogenetica intermedia 67%43% Citogenetica sfavorevole 75%76%

21 Rilevamento FLT3 D835 mut Estrazione di DNA Amplificazione con primers specifici sulla regione TK Digestione con Eco RV Corsa elettroforetica su gel 2% agarosio Visualizzazione agli UV Le bande non digerite (mutate) sono sequenziate

22 FLT3 D835 mut Presente nel 5-10% dei casi di LAM CN Ha un minore impatto sulla prognosi rispetto a FLT3- ITD

23 FLT3: considerazioni Attualmente FLT3 è un ottimo marker prognostico in pazienti a citogenetica negativa Nei pazienti a citogenetica nota deve essere correlato con la specifica alterazione

24 FLT3: livelli di espressione I livelli di espressione di FLT3 correlano con la conta dei blasti nel midollo Sono più alti in M5, bassi in M3

25 FLT3: livelli di espressione Ancora pochi studi tendono a considerare i livelli di espressione di FLT3 wt un utile marker prognostico

26 WT1:nuovo marker molecolare WT1 è una proteina con probabile funzione di oncosoppressore che recentemente è stato correlato a molte forme leucemiche Presenta tre domini zinc-finger codificati dagli esoni 7 e 9 in grado di legare il DNA Il suo mRNA è espresso a bassi livelli nel paziente sano, invece nel paziente leucemico è iper-espresso

27 WT1: PCR Real Time Estrazione RNA dal campioni Retrotrascrizione a cDNA Amplificazione del cDNA di WT1 e di Abl (gene housekeeping) N° copie WT1/N° copie Abl x 10 4

28 Range di riferimento in campione normale

29 Range di riferimento in campione patologico

30 WT1 Diventa fondamentale la quantizzazione dell’mRNA di WT1 per: Diagnosi di leucemia acuta Follow up del paziente nel tempo. È evidente che mediante WT1 possano essere seguiti anche pazienti privi di alterazioni citogenetiche e molecolari evidenti

31 WT 1 e inv16 (CBFβ-MYH11)

32 WT1 e inv16 post allotrapianto

33 Casi Clinici Threshold cycle Log starting quantity, copy number Leucemia acuta T(8;21): NCN 369 AREB in evoluzione: NCN 1794 AREB stazionaria: NCN 137

34 WT1:vantaggi WT1 appare più sensibile degli altri markers genetici precedentemente utilizzati WT1 rappresenta un marker prognostico di altissima importanza nel prevedere l’andamento di una terapia o la ricaduta del paziente

35 WT1: aggiornamenti Recentemente, si è osservata anche una correlazione tra il grado mutazionale di WT1 e la prognosi Sono state riscontrate mutazioni negli esoni 7 e 9 che determinano una perdita dei domini zinc-finger Ciò non comporta una diversa risposta alla terapia, bensì una maggiore possibilità di ricaduta

36 Mutazioni di WT1 e prognosi

37 Correlazione tra WT1 mutato ed alterazioni molecolari classiche

38 WT1: considerazioni Al momento, WT1 rappresenta il marker prognostico più importante per il follow up delle leucemie Ha infatti valore prognostico in tutti i tipi di leucemia È utile però valutare ogni singolo caso indipendentemente

39 Conclusioni Con il termine LAM si intende un insieme eterogeneo di patologie ematologiche La individuazione di marker molecolari è fondamentale per inquadrare le LAM in sottogruppi distinti per prognosi e scelte terapeutiche Le recenti scoperte, principalmente di WT1 e FLT3, sono di notevole supporto alla diagnosi e al follow up

40 Grazie per l’attenzione!