I ROS e il controllo ormonale della PCD L’accumulo dei ROS è coinvolto con la regolazione della morte cellulare Il perossido d’idrogeno e l’anione superossido.

Presentazione sul tema: "I ROS e il controllo ormonale della PCD L’accumulo dei ROS è coinvolto con la regolazione della morte cellulare Il perossido d’idrogeno e l’anione superossido."— Transcript della presentazione:

1 I ROS e il controllo ormonale della PCD L’accumulo dei ROS è coinvolto con la regolazione della morte cellulare Il perossido d’idrogeno e l’anione superossido giocano un ruolo chiave in questo processo I segnali derivanti dai ROS interagiscono direttamente o indirettamente con diverse altre pathway di signalling come quella indotta dal NO e con gli ormoni da stress SA, JA ed Et L’interazione e il bilanciamento di queste pathway determina la vita e la morte della cellula

2 PCD La morte cellulare associata con l’HR è regolata geneticamente ed è una forma di PCD come evidenziato dal comportamento di mutanti in mais, pomodoro e Arabidopsis che stimolano spontaneamente la PCD anche in assenza del patogeno Questi mutanti che mimano la morte cellulare (lesion- mimic) possono essere separati in 2 classi: –I cosiddetti initiation mutants che sviluppano lesioni spontanee di una certa grandezza che sono all’apparenza simili alle normali lesioni-HR stimolate dal patogeno –I propagation mutants che invece mostrano fenomeni di diffusione incontrollata di eventi di morte cellulare Tipici esempi di propagation mutants sono lsd1 e rcd1 di Arabidopsis e in questi casi l’anione superossido (aso) che si produce nell’apoplasto è necessario e sufficiente per stimolare la diffusione della PCD

3 PCD L’esistenza di 2 classi di mutanti suggerisce processi geneticamente distinti sono coinvolti nella formazione delle lesioni Questo implica che un insieme di segnali tra le cellule morenti e quelle vicine ancora sane è in grado di determinare l’estensione delle lesioni Quindi è lecito chiedersi quale sia la natura dei processi che propagano o bloccano la diffusione della morte cellulare regolando in tal modo l’estensione della propagazione delle lesione stesse

4 Il controllo ormonale della PCD dipendente da ROS 3 ormoni, l'acido salicilico, l'acido jasmonico e l'etilene, sono particolarmente importanti nella regolazione della morte cellulare stimolata dai ROS Le pathway di questi ormoni non operano indipendentemente ma sono, piuttosto, legate insieme in una complessa rete di interazioni (come verificato attraverso lo studio del mutante hrl1 di Arabidopsis)‏ Quindi la sensibilità di una cellula vegetale verso un tipo di ormone è almeno in parte stabilita attraverso il cross-talk di molteplici ormoni

5 Interazioni ormonali e PCD dip. da ROS La NADPHox RBOH viene attivata da flussi ionici e cascate PK, l'azione dei ROS è amplificata e la morte cellulare viene indotta attraverso l'SA nel sito d'infezione. Durante l'inizio della PCD il JA-signalling è soppresso da SA ed Et. Da questi primi siti di lesione un burst di produzione di Et diffonde nelle cellule vicine e induce competenza per la PCD In pomodoro l'Et-signalling è richiesto per l'accumulo di SA e per la diffusione della morte cellulare durante la formazione dei sintomi dopo un attacco di un patogeno virulento

6 Interazioni ormonali e PCD dip. da ROS Qual'è il segnale che viene acceso da SA ed Et per stimolare le cellule ad essere competenti? L'aso è attivamente prodotto nelle lesioni e poi, durante la diffusione della morte cellulare, in una fila di cellule avanti al fronte di avanzamento della PCD Questo pattern suggerisce che l'aso sia il segnale attraverso cui l'SA e l'Et stimolano la PCD, quindi l'Et e l'aso sono sinergici nella diffusione della PCD e quindi nell'allargamento delle lesioni

7 Interazioni ormonali e PCD dip. da ROS Quindi l’aso passa dalle cellule morenti alle cellule adiacenti Ma la morte cellulare è un segnale che porta anche alla produzione di JA che stimola il contenimento delle lesioni Il JA può impedire l'allargamento delle lesioni in diversi modi ad es. attraverso la soppressione della sintesi di SA e del suo relativo signalling L'attenuazione della sensibilità all'Et mediata dal JA contribuisce a bloccare la diffusione della PCD

8 Cross-talk ormoni-ROS-PCD Quindi l'estensione delle lesioni da HR è sotto il controllo ormonale I ROS, l'SA e la PCD funzionano in un loop a feedback che si autoalimenta, mentre l'Et serve per stimolare continuamente l'accumulo di ROS Il loop indica quindi che l'accumulo di ROS insieme al SA induce la PCD, l'Et serve per amplificare la sintesi di ROS (feedback positivo) che promuove la diffusione delle lesioni

9 Cross-talk ormoni-ROS-PCD L'incremento di JA, sia attraverso l'attivazione della sua biosintesi da parte dei ROS (LOX dependent JA pathway) o attraverso l'aumento di disponibilità del substrato (acido linolenico) proveniente dalle cellule morte, agisce come regolatore negativo del ciclo di morte cellulare legata allo stress ossidativo e può scavalcare l'effetto dell'Et nel promuovere la formazione dei ROS Questo incremento di JA risulta quindi nel contenimento delle lesioni cellulari

10 L'interazione orzo-Blumeria Blumeria graminis f.sp. Hordei (Bgh) è un patogeno biotrofico che necessita di un efficiente penetrazione della parete cellulare, lo sviluppo di un austorio funzionale e il mantenimento dell'integrità delle cellule dell'ospite per stabilire una reazione compatibile con l'orzo La resistenza a Bgh è espressa prevenendo la penetrazione attraverso una risposta di cell wall reinforcement localizzata e dall'HR. La prima reazione, ovvero il CWR, è osservata durante la PTI mentre la seconda avviene attraverso l'interazione con il fattore R – Mla Durante l'interazione con Bgh, i ROS si accumulano nell'epidermide e nel mesofillo fogliare vicino ai siti d'infezione

11 Pattern subcellulare dell’accumulo di ROS L’accumulo di H 2 O 2 avviene in 3 fasi: – la prima (0-3h) coincide con l’adesione del tubo germinativo primario non infettivo (A) – La seconda (3-14h) è quando il patogeno cerca di penetrare attraverso l’ifa di penetrazione che si sviluppa dall’appressorio. L’accumulo si ha nel sito di attacco, nelle papille e nelle pareti delle cellule anticlinali. Il pattern e l’intensità di produzione di H 2 O 2 dipende dall’esito della penetrazione (nelle reazioni compatibili scarsa produzione, alta in quelle incompatibili)‏(B) – La terza fase risulta nella diffusione di H 2 O 2 in tutta la cellula, inizialmente si accumula sia nell’interfaccia mesofillo-epidermide o vicino ai siti di penetrazione in dipendenza del tipo di R gene che media la risposta difensiva. Questa fase è sempre legata alla seguente morte cellulare e all’arresto della diffusione del patogeno

12 Pattern subcellulare dell’accumulo di ROS In contrasto con l’accumulo di H 2 O 2, l’aso si accumula (fase I) nelle cellule epidermiche attaccate solo nell’interazione compatibile, indicando che l’aso è implicato nell’accessibilità cellulare Infatti l’aso non si trova in associazione con la formazione di papille come l’H 2 O 2 L’aso inoltre non viene rilevato nelle cellule attaccate che sono sottoposte ad HR. Invece le cellule adiacenti lo producono attivamente (Fase II) Da questi dati emerge che l’H 2 O 2 è un segnale e forse stimola la morte ipersensibile mentre l’aso aiuta a delimitarla e diffonderla in un dato distretto cellulare

13 Schema degli eventi

14 Il ruolo di MLO nel bilancio redox e nell’interazione La proteina MLO potrebbe svolgere un ruolo come regolatore negativo dei meccanismi di difesa e di PCD nell’orzo La sua espressione è stimolata dall’attacco patogenico e dallo stress ossidativo suggerendo quindi che MLO agisca come putativo modulatore dello stato redox endocellulare MLO e l’accumulo di aso sono legati funzionalmente. Infatti MLO è una proteina simile ad un GPCR che interagisce in modo calcio-dipendente con la calmodulina ed è quindi capace di regolare il funzionamento della NADPHox e quindi la produzione di aso è quindi ipotizzabile che MLO sia capace di antagonizzare le risposte difensive impedendo o regolando la produzione di ROS in seguito a riconoscimento del patogeno

15 Il ruolo di MLO nel bilancio redox e nell’interazione L’accessibilità dell’orzo a varietà virulente di Bgh potrebbe quindi essere associata con un incremento nella capacità di scavenging Infatti essendo l’H 2 O 2 fondamentale per la fase I e III di resistenza a Bgh e per lo scatenamento dell’HR è normale che le capacità antiossidanti vengano stimolate in varietà suscettibili di orzo Quindi un patogeno di “successo” probabilmente sopprime, in questo sistema, le difese della pianta dipendenti dall’HP stimolando, attraverso MLO e l’aso, la sopravvivenza delle cellule dell’ospite Tale comportamento è legato allo stile di vita biotrofico di Blumeria graminis f.sp. hordei

16 mlo mutants exhibit perturbed cell death control, resulting in spontaneous cell death in response to developmental or abiotic cues. The wild type genes appear to function as negative regulators of programmed cell death. Barley mlo encodes the first-identified member of a novel class of plant proteins, predicted to be membrane bound and functioning in a cell-autonomous fashion.

17 Barley MLO is a G-protein coupled receptor

18 Copyright ©2002 American Society of Plant Biologists Piffanelli, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:1076-1085 Inactivation of the MLO protein leads to enhanced H2O2 accumulation at epidermal cells and to cell death in the mesophyll

19 Copyright ©2002 American Society of Plant Biologists Piffanelli, P., et al. Plant Physiol. 2002;129:1076-1085 Bgh-triggered cell death in a partially resistant mlo mutant

20 Model of assumed MLO corruption by the powdery mildew fungus in barley Biochemical Society Transactions www.biochemsoctrans.org Biochem. Soc. Trans. (2005) 33, 389-392 Biochemical Society Transactions www.biochemsoctrans.org Biochem. Soc. Trans. (2005) 33, 389-392

21 Le RNS L‘ossido nitrico (NO) è un altro importante fattore che è richiesto per l'induzione della PCD mediata da ROS. In soia il rapporto tra NO e l'H 2 O 2 determina il momento di attivazione della PCD Un eccesso di aso o di può servire a ridurre l'NO e prevenire cosi l'accumulo di NO e di H 2 O 2 richiesti per l'attivazione della morte cellulare

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23 NO signaling nelle risposte di difesa Negli animali l'NO funziona come molecola segnale in diversi processi fisiologici tra cui il rilascio di neurotrasmettitori Inoltre in particolari condizioni patologiche l'NO è in grado di uccidere i microrganismi e le cellule tumorali attraverso i macrofagi La sintesi di NO è catalizzata dall'emoproteina NO sintasi calmodulina dipendente che ossida la L-arginina a NO e L-citrullina Una volta prodotto l'NO agisce attraverso delle modificazioni post- traduzionali e bersaglia in modo specifico i residui di cisteina (S- nitrosilazione), di tirosina (nitrificazione) e il ferro e rame eme e non eme (nitrosilazione dei metalli) di un largo spettro di proteine L'interazione del NO con le proteine che contengono un gruppo eme è esemplificata dalla sua interazione con la guanilato ciclasi, infatti legandosi al suo gruppo prostetico, attiva l'enzima che produce cGMP

24 NO signaling nelle risposte di difesa Nelle piante gli enzimi responsabili della sintesi di NO sono la nitrato reduttasi (NR) e la AtNOS1 di At AtNOS1 appartiene al gruppo di enzimi dipendenti da calmodulina che catalizzano la formazione di NO ma ha scarsa omologia con quella animale, i mutanti Atnos1 mostrano una crescita ed una fertilità ridotta cosi come un'alterazione della capacità di chiusura degli stomi La localizzazione cellulare di AtNOS1 è nei mitocondri, suggerendo che l'enzima fornisca protezione contro i ROS prodotti nella fase oscura della fotosintesi limitando cosi l'ossidazione dei lipidi e delle proteine NO è prodotto inoltre nelle piante che vengono attaccate da patogeni e in seguito a elicitazione. Ad esempio l'elicitazione con criptogeina (una proteina di 10KDa prodotta da P. cryptogea) risulta in un rapido e transiente incremento della sua produzione

25 NO signaling nelle risposte di difesa La produzione di NO in seguito a elicitazione si localizza inizialmente nei plastidi e poi anche nel nucleo, nella membrana plasmatica e nel citoplasma. Questo suggerisce che la sintesi di NO potrebbe essere plastidiale e poi diffondere oppure avere più siti di produzione nella cellula NO è capace di modulare l'espressione di diversi geni di difesa che includono geni che codificano per PR proteins e di proteine correlate al metabolismo secondario A livello post-traduzionale l'NO promuove la S-nitrosilazione dei proteine coinvolte nel bilancio redox come la glutatione S transferasi e la S-adenosil- metionina sintetasi, inoltre sia il cGMP che il cADP possono mediare gli effetti mediato dal NO durante la difesa. Infatti ambedue i composti sono necessari per l'induzione dei geni della PAL e PR-1 Dato che questi secondi messaggeri attivano i canali per il calcio sia negli animali che nelle piante, è ipotizzabile che l'NO sia uno dei messaggeri chiave che governa la mobilizzazione del calcio durante la difesa Infatti NO partecipa all'incremento di calcio promuovendo il suo rilascio dai compartimenti intracellulari attraverso l'attivazione di canali specifici (RYR)‏

26 NO signaling nelle risposte di difesa Nei mammiferi l'NO è un potente induttore di apoptosi e il meccanismo principale di stimolazione avviene attraverso la sua reazione con l'aso per generare il perossinitrito (ONOO - ) un composto fortemente citotossico che causa una nitrosilazione incontrollata dei residui di tirosina in diverse proteine Nelle piante l'HR dipendente da NO non è mediata dall'ONOO - ma risulta piuttosto dall'azione combinata del NO con l'H 2 O 2 quando questa è formata per dismutazione dall'aso. Inoltre questi due composti sono in grado di regolare reciprocamente la propria sintesi Ad esempio H 2 O 2 esogena stimola la produzione di NO attraverso un processo dipendente dai flussi di calcio, mentre l'NO è richiesto per l'attivazione di RBOH

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28 Necrotrophic fungi are unable to occupy living plant cells How such pathogens survive first contact with living host tissue and initiate infection is therefore unclear. the necrotrophic grey mold fungus Botrytis cinerea undergoes massive apoptotic-like programmed cell death (PCD) following germination on the host plant Manipulation of an antiapoptotic gene BcBIR1 modified fungal response to PCD-inducing conditions.

29 strains with reduced sensitivity to PCD were hyper virulent, while strains in which PCD was over- stimulated showed reduced pathogenicity. Similarly, reduced levels of PCD in the fungus were recorded following infection of Arabidopsis mutants that show enhanced susceptibility to B. cinerea Botrytis PCD machinery is targeted by plant defense molecules, and that the fungal anti-apoptotic machinery is essential for overcoming this host-induced PCD and hence, for establishment of infection

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