Candidata: Samia Mofti

Presentazione sul tema: "Candidata: Samia Mofti"— Transcript della presentazione:

1 Candidata: Samia Mofti
Il lievito come modello per selezionare inibitori dell’enzima deneddilante CSN5 Candidata: Samia Mofti Relatore: Teresa Rinaldi Anno accademico 2014/2015

2 INDICE ARGOMENTI Introduzione Scopo del lavoro Risultati Conclusione
Prospettive future

3 INTRODUZIONE COP 9 Signalosoma (CSN)
Il CNS è un complesso multiproteico altamente conservato negli eucarioti

4 INTRODUZIONE COP 9 Signalosoma (CSN)
La funzione principale del CSN è quella di inattivare le CRL (un gruppo di ubiquitin-ligasi) attraverso il processo di deneddilazione, ovvero idrolizzando il legame isopeptidico presente tra la proteina scaffold Cullina e NEDD8, una proteina ubiquitin-like

5 INTRODUZIONE COP 9 Signalosoma (CSN) E’ costituito da 8 subunità

6 INTRODUZIONE CSN5 Il CSN5 è la subunità catalitica del CSN, contenente un sito attivo di zinco-metalloenzima

7 INTRODUZIONE CSN5 È coinvolto nel processo di deneddilazione delle CRL, attraverso il taglio di NEDD8 dalle Culline

8 INTRODUZIONE CSN5 Nelle cellule superiori la sua inattivazione manifesta un fenotipo letale embrionale e la sua overespressione è instabile quindi difficilmente studiabile È overespresso in moltissimi tumori! È la subunità più conservata.

9 S. cerevisiae INTRODUZIONE E’ un organismo
unicellulare eucariotico che può essere utilizzato per studiare le funzioni di geni conservati nell’evoluzione fino ai mammiferi, come il CSN5

10 l’assenza del gene CSN5 non mostra un fenotipo letale…
INTRODUZIONE S. cerevisiae In lievito l’assenza del gene CSN5 non mostra un fenotipo letale… Quindi studiabile!!

11 INDICE ARGOMENTI Introduzione Scopo del lavoro Risultati Conclusione
Prospettive future

12 SCOPO DEL LAVORO Lo scopo della mia tesi è stato quello di utilizzare il lievito S.cerevisiae come modello per lo screening di piccole molecole inibitorie della funzione deneddilante di CSN5, sfruttando la caratteristica unica di questi funghi di poter sopravvivere senza il gene CSN5.

13 INDICE ARGOMENTI Introduzione Scopo del lavoro Risultati Conclusione
Prospettive future

14 RISULTATI Modelling molecolare

15 RISULTATI Modelling molecolare
Abbiamo mutato in silico Arg106 con l’alanina (R106A) nella struttura cristallografica di CSN5

16 RISULTATI Modelling molecolare
E’ stata aumentata la distanza tra lo ione Zn catalitico e il residuo di Ala106 che ha portato ad una notevole accessibilità del sito attivo

17 RISULTATI Modelling molecolare Abbiamo utilizzato una libreria
di composti naturali e loro derivati in conformità con la struttura di CSN5. Quindi, abbiamo selezionato in silico 11 frammenti molecolari come potenziali inibitori del CSN5.

18 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5

19 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
La nistatina è un antibiotico che blocca la deposizione dell’ergosterolo; il fenotipo sensibile di Δcsn5 è una conseguenza dell’alterazione del suo metabolismo lipidico

20 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
Siamo andati ad osservare se le 11 molecole selezionate inibiscano realmente la funzione di CSN5 mostrando un fenotipo sensibile delle cellule wild type in presenza degli inibitori e 0,2μg/ml di nistatina.

21 sul Cdc53 (Cul1 del lievito), che è il target principale di CSN5.
RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5 Per verificare l’ipotesi che sia realmente inibita la funzione deneddilante di CSN5, abbiamo effettuato un analisi Western Blot per valutare l’attività deneddilante sul Cdc53 (Cul1 del lievito), che è il target principale di CSN5.

22 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
I risultati ottenuti sia con l’analisi di densità ottica che con il Western Blot hanno mostrato che le molecole 2 e 4 sono quelle che funzionano meglio.

23 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
E’ stato possibile dimostrare che le molecole 2 e 4 causano una sensibilità alla nistatina e un’inibizione dell’attività deneddilante di CSN5

24 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
Inibitore 2 Inibitore 4

25 Il CSN5 ha un ortologo, l'enzima deubiquitinante proteasomale Rpn11.
RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5 Il CSN5 ha un ortologo, l'enzima deubiquitinante proteasomale Rpn11. Entrambe le proteine condividono lo stesso dominio JAMM, quindi, anche se le molecole sono state specificamente progettate per CSN5, non possiamo escludere che in vivo le molecole potrebbero influenzare la funzione di Rpn11.

26 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
Per verificare che l'inibizione deneddilante è un effetto diretto delle molecole nel sito catalitico di CSN5 abbiamo guardato il profilo di proteine ubiquitinate nelle cellule trattate con l'inibitore 2; come controllo è stato utilizzato il mutante proteasomale rpn11-m1, che accumula proteine poliubiquitinate dovuta al blocco della degradazione

27 RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5
Abbiamo voluto valutare se l’inibizione catalitica di CSN5 è in grado di mimare gli effetti trascrizionali osservati in Δcsn5 * I dati sono stati normalizzati per W303+DMSO

28 down-regolato in misura simile a quello del ceppo CSN5 deleto
RISULTATI Analisi dei potenziali inibitori dell’enzima CSN5 Abbiamo osservato che in presenza delle molecole inibitorie il trascritto di entrambi i geni risulta down-regolato in misura simile a quello del ceppo CSN5 deleto * I dati sono stati normalizzati per W303+DMSO

29 INDICE ARGOMENTI Introduzione Scopo del lavoro Risultati Conclusione
Prospettive future

30 CONCLUSIONI In conclusione,
siamo riusciti ad identificare due piccole molecole come inibitori selettivi della funzione deneddilante del CSN5.

31 INDICE ARGOMENTI Introduzione Scopo del lavoro Risultati Conclusione
Prospettive future

32 PROSPETTIVE FUTURE Sicuramente il prossimo passaggio sarà quello di testare queste molecole su culture cellulari in vivo di tipo tumorale che overesprimono il CSN5, oppure su piante che sono state a lungo studiate per capire la funzione del complesso CSN

33 GRAZIE PER L’ATTENZIONE