Arrays di acidi nucleici

Presentazione sul tema: "Arrays di acidi nucleici"— Transcript della presentazione:

1 Arrays di acidi nucleici

2 A B C D mRNA 1 a b g d 2 e z h q 3 i k l m cDNA 4 n x o p
Sia i macroarrays che i microarrays sono stati sviluppati per soddisfare l’esigenza di misurare contemporaneamente l’espressione di più geni. Entambe le tecnologie si basano sullo stesso principio: 2. L’array viene ibridizzato con una miscela complessa di molecole marcate rappresentative dell’mRNA espresso dalle cellule in esame 1. Come sonda si usano olgonucleotidi o molecole di cDNA non marcati, immmobilizzati in posizioni precise di un supporto solido A B C D mRNA 1 a b g d 2 RT Nucleotidi marcati e z h q 3 i k l m cDNA 4 n x o p Array

3 I saggi di microarray sono basati sul principio
dell’ibridazione inversa

4 Macrorray Le molecole sonda vengono legate a membrane di nylon
Come tracciante viene utilizzata la radioattività Analisi di qualche decina o poche centinaia di geni

5 Microrray: tecnologia Affymetrix
Le molecole sonda sono oligonucleotidi sintetizzati direttemente su microchip di silicio con un metodo fotolitografico. Su ogni microchip vengono sintetizzati fino a oligonucleotidi diversi. La metodica è stata sviluppata in modo da permettere misurazioni assolute dell’abbondanza dei singoli mRNA

6 TGAACTGATAGATGACGTAG
Schema metodica mRNA TGAACTGATAGATGACGTAG Poly A Poly A Design complementary oligo ACTTGACTAT C T AC TG CATC Chemically synthesize oligo on chip identical oligos per feature Label – Label – Hybridize labeled total mRNA Detect label

7 Thousands of identical probes/feature
Microrray: tecnologia Affymetrix 50µm ~ chips/wafer Thousands of identical probes/feature 1.28cm 1.28cm up to ~ 400,000 features/chip

8 Sintesi fotolitografica
Lamp Mask Chip

9 107-108 identical probes/feature
Ibridazione e rivelazione Phycoerythrin Streptavidin Phycoerythrin Streptavidin Biotin Biotin Biotin identical probes/feature

10 Rappresentazione di ogni trascritto sul chip
Perfect Match mRNA * * * * * * Mismatch Perfect Match Mismatch Per ogni gene vengono sintetizzati 20 oligonucleotidi uguali all’mRNA (perfect match). Per ognuno di questi, ne viene sintetizzato un altro con una base sbagliata (mismatch). L’espressione del gene si ottiene sommando le letture dei perfect match e sottraendo quelle dei mismatch. Questi accorgimenti sono indispensabili per eliminare i problemi dovuti alla eventale ibridizzazione disugule o non specifica degli oligonucleotidi.

11 Letture possibili Detectable Undetectable Undetectable Perfect Match
Mismatch Undetectable Undetectable

12

13 PIN

14 PRINTING

15 INK JET PRINTING

16 cDNA Microarray

17 Modalità di marcatura

18 Modalità di marcatura

19 Microrray di cDNA (o di oligonucleotidi lunghi)
Le molecole sonda sono cDNA o oligonucleotidi lunghi paia di basi, sintetizzati tradizionalmente e egati ad un vetrino da microscopio per mezzo di un processo di stampa a getto. Su ogni vetrino trovano posto fino a geni. L’intensità del segnale per ogni gene dipende dai livelli di messaggero e dall’efficienza di ibridazione. Pertanto questa metodica non consente misurazioni assolute ma solo relative. Metodica comparativa. Per confrontare tra di loro più campioni è necessario confrontarli tutti con un campione standardizzato.

20 mRNA mRNA Reverse Reverse Labeled Labeled transcription transcription
1 1 st st strand strand cDNA cDNA Sample 1 (test) Sample 2 (reference) Hybridization on the Hybridization on the cDNA microarray cDNA microarray

21 Bead Arrays

22

23 Analisi statistica a tutti i livelli
Identificazione degli spot

24 Analisi statistica a tutti i livelli
Eliminazione degli artefatti

25 Analisi statistica a tutti i livelli
Normalizzazione

26 Analisi statistica a tutti i livelli
Identificazione dei geni modulati

27 Analisi statistica a tutti i livelli
Clustering dei dati

28 Analisi statistica a tutti i livelli
Clustering dei dati

29 Attenzione !!! L’enorme numero di geni analizzati dai microarray è il punto più forte, ma anche più debole della metodica. Infatti sono possibili moltissimi errori (importanza di avere campioni replicati), e il trattamento dell’informazione non è banale! L’acquisizione dei dati è solo la parte iniziale della procedura. La parte più complicata è l’elaborazione della enorme quantità di dati generati da questi esperimenti, necessaria per rispondere ai quesiti biologici di partenza. I dati più significativi devono essere poi verificati con altri sistemi (northern, real time RT-PCR)

30 Importanza della bioinformatica per la determinazione del significato biologico degli esperimenti

31 Applicazioni Definizione delle basi molecolari e identificazione di nuovi markers prognostici per neoplasie e altre patologie

32 Applicazioni Definizione delle basi molecolari e identificazione di nuovi markers prognostici per neoplasie e altre patologie

33 Applicazioni Studio del controllo trascrizionale. In particolare, identificazione dei siti di legame per i fattori trascrizionali coinvolti nella coregolazione

34 Applicazioni

35 Applicazioni Annotazione del genoma, ossia identificazione delle regioni effettivamente trascritte

36

37 Farmacogenomica e tossicogenomica
Applicazioni Farmacogenomica e tossicogenomica