Tesi di Specializzazione di: D.ssa Monia Rinaldini

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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI “G. D’ANNUNZIO”. CHIETI Facoltà di Medicina e Chirurgia Scuola di Specializzazione in Genetica Medica Direttore Prof G. Palka Analisi cromosomica su villi coriali: diecimila casi. Affidabilità e problematiche della diagnosi cromosomica prenatale nel primo trimestre di gravidanza Relatore: Chiar.mo Prof. G. Palka Tesi di Specializzazione di: D.ssa Monia Rinaldini ANNO ACCADEMICO

Le linee guida protocollari della Società di Genetica
Villi coriali (CVS) I tessuti placentari possono mostrare aberrazioni cromosomiche non specificatamente fetali, ma confinate alla placenta CVS citotrofoblasto mesoderma Le linee guida protocollari della Società di Genetica consigliano l’utilizzo sia della metodica semidiretta che colturale nella attività diagnostica metodo semidiretto metodo a coltura tessuti placentari

Scopo Presentare una casistica di analisi cromosomiche consecutive su campioni di villi coriali (CVS) eseguite con entrambi i metodi. Evidenziare affidabilità e problematiche della diagnosi cromosomica prenatale mediante prelievo di villi coriali nel primo trimestre di gravidanza.

Materiali e metodi (1) Indicazioni per l’indagine citogenetica
Segni ecografici alterati Età materna Familiarità per anomalie cromosomiche Genitori portatori di anomalie cromosomiche Marcatori sierici ad aumentato rischio

Analisi cromosomica su villi coriali
Materiali e metodi (2) Analisi cromosomica su villi coriali Metodo semidiretto Metodo a coltura Bandeggi: QFQ di routine GTG occasionale DA-DAPI occasionale Metafasi analizzate in totale su entrambi i preparati: 20 per cariotipo omogeneo Numero più esteso nei casi di mosaicismo

Materiali e metodi (3) Analisi di verifica e controllo di aberrazioni cromosomiche di dubbia interpretazione Analisi cromosomiche su colture di liquido amniotico Identificazione di piccoli marcatori cromosomici (FISH) Analisi cromosomiche su colture di sangue periferico postnatale Esclusione di Disomia Uniparentale (UPD)

liquido amniotico (LA)
Risultati. Tab CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni numeriche autosomiche. (1) formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 47 +21 70 confermato coltura TAB +18 16 46 XX 2 47,XX,+18 47,XX,+18 LA markersUS +13 conferm coltura mos conferm LA mos post TAB 5 1 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale +10 confermato cute post TAB ongoing +15 1/UPD-/fenotipo normale confermato LA post SAB +16 +20 +ESAC failed coltura confermato LA (DN)

liquido amniotico (LA)
Risultati. Tab CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni numeriche autosomiche. (2) formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 46/47 +21 6 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 3 conferm coltura mos conferm LA mos TAB 1 confermato coltura (47, +21) perso al follow up confermato LA 46 XX 46/47,+21 coltura 46/47,+21 LA TAB/segni clinici XY 46,XY LA +18 conferm coltura igroma cistico +13 7 +3 2 +8 +22 +7 confermato coltura no UPD; FU normale +9 failed coltura +12 +ESAC materno ish18- 46/47,+18 +invdup15

trofoblastoFISH 14/300-Y+;TAB
Risultati. Tab CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Aberrazioni gonosomiche. citotrofoblasto casi coltura mesoderma follow up 45,X /46,XY 5 46,XY maschio normale 45,X /46,XX 2 46,XX LA 46,XX 45,X /46,XX /47,XX,+21 1 (2/27/1) 45,X 1 45,X / 46,XX perso al follow up 6 3/6 NT > 4 - TAB 46,X,dic(Y)(q11.2) LA 45,X / 46,X,dic(Y)(q11.2) trofoblastoFISH 14/300-Y+;TAB 47,XXY confermato 47,XYY 3 47, XXX

Risultati. Tab 3. 10000 CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma
Risultati. Tab CVS. Analisi del trofoblasto e mesoderma. Riarrangiamenti strutturali. formula cromosomica (trofoblasto e coltura) familiarità controllo citogenetica su LA o tessuto follow up 46,XX t (13;19) (p11;p11) dn confermato fenotipo normale (1;18) (p32;q11.2) (4;10) (q33;q22) 46,XX/46,XX -11 + der (11) t (11p;?) malformazioni TAB 20w 46,XY der (18) t (3;18) (p21.3;p11.3) pat malformazioni TAB 14w 46,XY/46,XY der (15) t (15p;?) 46, XY der (18) t (14;18) (q21;q12) der (20) dup 20 (p11.1p11.2) no malformaz TAB 11w ring (15q) del 5 (p13) 46, XX 46, XX, del (5)(p12) SP cri du chat/morte perinatale 45,XX o XY der (13;14) (q10;q10) mat 6 casi 4/UPD negativa/ fenotipo normale 3 casi 1/UPD negativa/fenotipo normale 45, XY ish der (15;21) ishder (15;22)(q10;q10) ishder (15;22)(q10;q10)UPDneg

Risultati (Tab.1) Trisomia 21
formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up confermato coltura TAB 46/ non conferm coltura non confermato LA FUfenotipo normale 3 conferm coltura mos conferm LA mos TAB 1 confermato coltura perso al (47,+21) follow up 1 non conferm coltura confermato LA TAB 46 XX 1 46/47,+21 coltura 46/47,+21 LA TAB/ segniclinici 46 XY 1 46/47,+21 coltura 46,XY LA FU fenotipo normale

formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up confermato coltura TAB 46XX 2 47,XX,+18 47,XX,+18 LA markersUS 46/ non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/ conferm coltura confermato LA igroma cistico

formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up confermato coltura TAB 46XX 2 47,XX,+18 47,XX,+18 LA markersUS 46/ non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/ conferm coltura confermato LA igroma cistico Tutti i casi di trisomia 18 a mosaico dimostratisi veri nel feto erano accompagnati da anomalie ecografiche rilevanti, onfalocele e igroma cistico

formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up conferm coltura mos conferm LA mos post TAB confermato coltura TAB non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/ non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale

Risultati (Tab.1) Altre trisomie omogenee
formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up confermato coltura confermato cute post TAB confermato coltura non confermato LA ongoing non conferm coltura non confermato LA 1/UPD-/fenotipo normale confermato LA post SAB confermato coltura non confermato LA FU fenotipo normale non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale conferm coltura mos non confermato LA FU fenotipo normale non conferm coltura FU fenotipo normale 47 +ESAC 1 failed coltura confermato LA (DN) FU fenotipo normale 47 +ESAC 2 confermato coltura confermato LA (DN) FU fenotipo normale

Risultati (Tab.1) Altre trisomie a mosaico
formula trofoblasto casi mesoderma liquido amniotico (LA) follow up 46/ non conferm coltura FU fenotipo normale 46/ non conferm coltura FU fenotipo normale 46/ non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/ confermato coltura non confermato LA no UPD; FU normale 46/ failed coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/ non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 +ESAC 1 confermato coltura materno 1 confermato coltura non confermato LA FU fenotipo normale 1 failed coltura non confermato LA FU fenotipo normale 46/47 ish18- 1 non conferm coltura 46/47,+18 perso al follow up 46/47 +invdup15 1 non conferm coltura non confermato LA FU fenotipo normale 1 confermato coltura confermato LA perso al follow up

Risultati (Tab.2) Aberrazioni gonosomiche
citotrofoblasto casi coltura mesoderma follow up 45,X /46,XY 5 46,XY maschio normale 45,X /46,XX 2 46,XX LA 46,XX 45,X /46,XX /47,XX,+21 1 (2/27/1) 45,X 1 45,X / 46,XX perso al follow up 6 3/6 NT > 4 - TAB 46,X,dic(Y)(q11.2) LA 45,X / 46,X,dic(Y)(q11.2) trofoblastoFISH 14/300-Y+;TAB 47,XXY confermato 47,XYY 3 47, XXX

Risultati (Tab.3) Traslocazioni reciproche apparentemente bilanciate
formula cromosomica familiarità controllo citogenetica follow up (trofoblasto e coltura) su LA o tessuto 46,XX t (13;19) (p11;p11) dn confermato fenotipo normale 46,XX t (1;18) (p32;q11.2) dn confermato fenotipo normale 46,XX t (4;10) (q33;q22) dn confermato fenotipo normale

Risultati (Tab.3) Aberrazioni cromosomiche strutturali sbilanciate
formula cromosomica familiarità controllo citogenetica follow up (trofoblasto e coltura) su LA o tessuto 46,XX/46,XX -11+der(11) t(11p;?) dn confermato malformazioni TAB 20w 46,XY-18+der(18) t(3;18)(p21.3;p11.3) pat confermato malformazioni TAB 14w 46,XY/46,XY-15+der(15)t(15p;?) dn 46, XY fenotipo normale 46,XY-14+der(18) t(14;18)(q21;q12) pat confermato malformazioni TAB 20w 46,XY-20+der(20)dup20(p11.1p11.2) dn confermato no malformaz TAB 11w 46,XYring(15q) dn confermato malformazioni TAB 20w 46,XXdel5(p13) dn 46,XX fenotipo normale 46,XX dn 46, XX, del (5)(p12) SP cri du chat/ morte perinatale

Risultati (Tab.3) Traslocazioni robertsoniane
formula cromosomica familiarità controllo citogenetica follow up (trofoblasto e coltura) su LA o tessuto 45,XX o XYder(13;14)(q10;q10) mat 6/confermato 4/UPDnegativa/ fenotipo normale 45,XX o XYder(13;14)(q10;q10) pat 3/confermato 1/UPDnegativa/ fenotipo normale 45,XYishder(15;21)(q10;q10) dn ishder(15;22)(q10;q10) ishder (15;22) (q10;q10)UPDneg

Trisomie autosomiche omogenee
Discussione Trisomie autosomiche omogenee Le trisomie 21 e 18 omogenee senza discrepanze tra trofoblasto e mesoderma, confrontate con trials internazionali, consentono di non dubitare dell’affidabilità nell’identificazione di queste due comuni trisomie. In due casi di trisomia 18 il trofoblasto mostrava cariotipo normale, mentre gli altri tessuti (mesoderma e liquido amniotico) mostravano trisomia 18 omogenea. Tali casi presentavano segni ecografici importanti: igroma ed onfalocele. La trisomia 13 ha mostrato un caso, sugli 8 totali, ove il trofoblasto positivo non ha trovato riscontro sugli altri tessuti.

Discussione Trisomie autosomiche omogenee
Le trisomie 10 e 15 in un caso su due si sono dimostrate rappresentative della condizione fetale sia che fossero viste solo nel trofoblasto o nel trofoblasto e mesoderma. Le trisomie 16 e 20 non sono mai state confermate nel feto. Nel campo delle trisomie autosomiche omogenee: 8 casi sono falsi positivi nel trofoblasto (talvolta anche nel mesoderma), con la esclusione solo delle trisomie 21 e 18; 2 casi falsi negativi in cui il trofoblasto manca di identificare la trisomia 18 omogenea.

Discussione Trisomie autosomiche a mosaico
Trisomia 21 a mosaico: 4 casi risultano veri mosaicismi; 7 casi risultano falsi positivi, di cui 6 hanno la trisomia confinata al trofoblasto, uno confinata al mesoderma; Un caso falso negativo con trofoblasto a cariotipo normale, mesoderma e liquido amniotico a mosaico. Trisomia 18 a mosaico: Un caso risulta vero mosaicismo (igroma cistico); 6 casi risultano falsi positivi con trisomia confinata al trofoblasto. Tutti gli altri casi di mosaicismo per aberrazioni numeriche autosomiche trovate nel trofoblasto in varia misura confermate o meno nella coltura di mesoderma, non vennero confermate sul liquido amniotico ed ebbero follow up normale.

Discussione Cromosomi marcatori (ESAC)
Marcatori sovranumerari omogenei: 3 casi de novo confermati su liquido amniotico ebbero fenotipo normale alla nascita, ma non furono disponibili per ulteriori studi; Marcatori sovranumerari a mosaico: un caso di origine materna; 3 casi non confermati; un caso +invdup(15) confermato; un caso complesso dove un marcatore non derivativo 18 confinato al trofoblasto del villo si associò ad un mosaicismo per trisomia 18 nel liquido amniotico: il caso fu perso al follow up.

Discussione Anomalie gonosomiche dei cromosomi
Corredi a 47 cromosomi: trisomia X, maschio a disomia X o Y, hanno trovato sempre conferma fetale; Monosomia X: 6 casi hanno trovato conferma nel mesoderma; 2 casi hanno mostrato mosaicismo con una linea maschile (cromosoma Y normale o derivativo); un caso ha mostrato mosaicismo con una linea 46,XX. Anomalie gonosomiche a mosaico: 8 casi di mosaicismo nel trofoblasto non hanno trovato conferma nella coltura di mesoderma;

Discussione Riarrangiamenti strutturali
Traslocazione reciproca bilanciata: 3 casi de novo hanno trovato conferma sui tessuti fetali. Riarrangiamenti sbilanciati: 5 casi hanno trovato conferma sui tessuti fetali; un caso di derivativo 15 a mosaico e un caso con delezione parziale del 5p non sono stati confermati su liquido amniotico con fenotipo normale (falsi positivi); Un caso con cariotipo femminile normale identificato in trofoblasto e coltura ha rivelato alla nascita delezione 5p12 su sangueperiferico e sindrome Cri du Chat con morte perinatale (falso negativo). Fig. 1-2

Fig.1. Metafase 46,XX (QFQ) da preparato semidiretto di trofoblasto. I cromosomi 5 a confronto con del(5)(p12) del cariotipo postnatale (GTG)

Fig.2. Metafase 46,XX (QFQ) da preparato colture di mesoderma. I cromosomi 5 a confronto con del(5)(p12) del cariotipo postnatale (GTG)

Discussione Riarrangiamenti strutturali
Traslocazioni robertsoniane: 9 casi familiari con t(13;14), negativi alla UPD 14 in 5 casi esaminati, hanno mostrato sempre follow up normale; un caso discordante fra villo coriale, liquido amniotico e sangue neonatale per una traslocazione tra un cromosoma 15 e 21 nel villo, che era 15 e 22 negli altri tessuti ha mostrato fenotipo normale.

Conclusioni Questa casistica decennale di casi mette in luce il principale problema biologico per l’affidabilità diagnostica dei villi coriali: il possibile confinamento placentare del cariotipo individuato con l’analisi dei tessuti del trofoblasto e a volte anche del mesoderma. 4 casi sui sono risultati normali nel trofoblasto ed un caso anche su coltura, si trattava di: due trisomie 18; un mosaicismo per trisomia 21; una delezione 5p – Cri du Chat;

Conclusioni Le aberrazioni numeriche autosomiche trovate sui villi coriali di questa serie mostrano immediata significatività solo per le trisomie comuni 18 e 21, mentre gli altri casi di trisomie omogenee necessitano di ulteriori controlli a prescindere dal dato del mesoderma. La presenza di 2 falsi negativi di trisomia 18 limita l’utilizzo del villo coriale come strumento rapido di verifica di dati ultrasonografici allarmanti

Conclusioni Fra le aberrazioni numeriche a mosaico sul trofoblasto solo la trisomia 21 sembra meritare attenzione circa la conferma su tessuti diversi e/o fetali, infatti il cariotipo normale su coltura non esclude la presenza di tale aberrazione nel feto. Un caso di falso negativo per la trisomia 21 a mosaico vera, esalta la necessità del cariotipo sul mesoderma come dato integrato alla diagnosi cromosomica sui villi coriali

Conclusioni Gran parte delle trisomie autosomiche meno frequenti e gran parte dei mosaicismi si sono dimostrate confinate alla placenta, così come i mosaicismi per le anomalie numeriche dei gonosomi. Anche gli riarrangiamenti strutturali non sfuggono al rischio del confinamento placentare essendosi dimostrati in 2 casi su 10 della nostra serie.

Conclusioni Nella coscienza delle problematiche biologiche insite nell’uso diagnostico di un tessuto annesso al feto, ma con una storia embrionale indipendente, l’analisi cromosomica sui villi coriali si dimostra strumento efficace e rapido adatto nelle gravidanze a rischio dove la tempestività della conoscenza del cariotipo supporta il managemant della gravidanza stessa. La attenta e completa applicazione dei protocolli diagnostici deve essere confortata da una completa informazione dei pazienti e dei loro consulenti sulle problematiche ed i limiti insiti nell’uso del tessuto dei villi coriali nella diagnosi cromosomica fetale allo scopo di evitare incaute e totalizzanti aspettative.

Un grazie particolare al Dr
Un grazie particolare al Dr. Lamberto Camurri ed ai colleghi del laboratorio HI-TECH di Parma, ai genetisti ed ai tecnici dei laboratori ARCELLA e BIOLAB di Padova e a tutti i colleghi Ostetrici che con il loro insostituibile lavoro hanno reso possibile questo studio.

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