Sistema di ricerca Entrez Insieme di banche dati contenenti svariati tipi di informazioni biomediche, interrogabile mediante un’unica interfaccia Concetto.

Presentazione sul tema: "Sistema di ricerca Entrez Insieme di banche dati contenenti svariati tipi di informazioni biomediche, interrogabile mediante un’unica interfaccia Concetto."— Transcript della presentazione:

1 Sistema di ricerca Entrez Insieme di banche dati contenenti svariati tipi di informazioni biomediche, interrogabile mediante un’unica interfaccia Concetto fondamentale: integrazione

2 Esempio di interrogazione PubMed Esercitazione 1: trovare articoli recenti e non troppo specialistici sulla proteina p53. Dopo averne scelto uno, identificare i documenti correlati esistenti nel database Esercitazione 2: trovare articoli recenti e ad elevato impatto pubblicati sulla proteina p53 da laboratori italiani Esercitazione 3: trovare gli articoli più importanti pubblicati su Nature, Cell o Science negli ultimi tre anni.

3 Come orientarsi nei database di sequenze? Miliardi di basi sequenziate Elevata ridondanza nei diversi database Sequenze di qualità molto variabile, sia per ciò che riguarda l’informazione primaria che per l’annotazione

4 Sequenziamento delle sole regioni esoniche (Expressed Sequence Tags) cDNA-library plasmidica direzionale Picking singoli cloni Preparazione DNA Primer 5’ 3’ Sequenziamento automatico Deposito in banca dati (300-700 bp)

5 AAAAAAAA mRNA (10 copie di cDNA nella library) ESTTratto non sequenziato del clone Inserti

6 Come orientarsi nei database di sequenze? Esercitazione 4: trovare con un’unica ricerca sequenze di cDNA ben annotate corrispondenti a geni implicati nel cancro del colon. Esercitazione 5: scegliere una sequenza e identificare le sequenze simili presenti nella banca dati. Esercitzione 6: analisi in silico dell’espressione genica

7 Principali database di sequenze GeneBank (Nucleotide, Protein) Unigene RefSeq Locus link (problema dei nomi molteplici) Entrez Gene Genome Structure

8 Allineamento di sequenze Perché è importante? Le caratteristiche funzionali delle molecole biologiche dipendono dalle conformazione tridimensionale che gli atomi costituenti assumono nello spazio. Questa a sua volta dipende dalla sequenza delle unità elementari (in genere si tratta di aminoacidi, ma lo stesso discorso vale anche per i nucleotidi). Molecole che hanno sequenza primaria simile tendono ad avere strutture secondarie e terziarie simili. Se due proteine sono identiche al 50%, è altamente probabile che la loro struttura tridimensionale sia quasi completamente sovrapponibile.

9 Sequenze identiche al 62% 10 20 30 40 50 60 Chymotrypsin MLGITVLAALLACASSCGVPSFPPNLSARVVGGEDARPHSWPWQISLQYLKNDTWRHTCG :..:..:.: : ::: :..::.. ::::::.:::.:::::.::::.: : :::: Elastase MIRTLLLSTLVAGALSCGDPTYPPYVT-RVVGGEEARPNSWPWQVSLQYSSNGKWYHTCG 10 20 30 40 50 70 80 90 100 110 Chymotrypsin GTLIASNFVLTAAHCISNTRTYRVAVGKNNLEVEDEEGSLFVGVDTIHVHKRWNALLLR- :.:::...:::::::::..:::::..:..:: : : ::: :.:. : ::: ::.. Elastase GSLIANSWVLTAAHCISSSRTYRVGLGRHNLYVA-ESGSLAVSVSKIVVHKDWNSNQISK 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 Chymotrypsin -NDIALIKLAEHVELSDTIQVACLPEKDSLLPKDYPCYVTGWGRLWTNGPIADKLQQGLQ :::::.:::. : :.: ::.::::..::..::::::::::: :::. : :::: Elastase GNDIALLKLANPVSLTDKIQLACLPPAGTILPNNYPCYVTGWGRLQTNGAVPDVLQQGRL 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 Chymotrypsin PVVDHATCSRIDWWGFRVKKTMVCAGGDGVISACNGDSGGPLNCQLENGSWEVFGIVSFG :::.:::: ::: ::.:.:::::::::.::::::::::::.: :.: :::::: Elastase LVVDYATCSSSAWWGSSVKTSMICAGGDGVISSCNGDSGGPLNCQASDGRWQVHGIVSFG 180 190 200 210 220 230 240 250 260 Chymotrypsin SRRGCNTRKKPVVYTRVSAYIDWINEKM-QL :: :::.:: :.:::: ::::::.. Elastase SRLGCNYYHKPSVFTRVSNYIDWINSVIANN 240 250 260

10 Sequenze identiche al 62%

11 Allineamento globale e allineamento locale Alcuni programmi, date due sequenze, generano in ogni caso l’allineamento migliore possibile tra di esse, su tutta la lunghezza. Questo tipo di allineamento prende il nome di allineamento globale. Non necessariamente un allineamento globale ha significato biologico. Altri programmi, date due sequenze, non le allineano necessariamente su tutta la lunghezza, ma vanno a cercare soltanto i tratti in cui l’omologia tra le due sequenze (ossia lo score) supera una certa soglia. In questi si parla di allineamento locale.

12 Come funziona BLAST? La sequenza di cui si vogliono trovare gli omologhi viene scomposta in tutte le possibili parole di una lunghezza prefissata (ad esempio due o tre se si tratta di aminoacidi) MLFFRRQPKHCSDTEF MLFLFFFFRFRRRRQRQPQPK PKHKHCHCSCSDSDTDTETEF Le parole di tre lettere vengono quindi cercate in tutte le sequenze della banca dati (operazione estremamente rapida)

13 Query: MLFFRRQPKHCSDTEF MLFLFFFFRFRRRRQRQPQPK PKHKHCHCSCSDSDTDTETEF Subject: ASDDERTGLFDRKQPKACMDSEFKATT QPK ::: In seguito l’allineamento viene esteso HCSDTEF : :.: MLFFRR :: :. Subject: ASDDERTGLFDRKQPKACMDSEFKATT QPK ::: Query:

14 Gapped BLAST

15

16 Versioni disponibili del programma Blast BlastN = ricerca in un database di sequenze nucleotidiche le sequenze omologhe ad una sequenza nucleotidica data. BlastP = ricerca in un database di sequenze aminoacidiche le sequenze omologhe ad una sequenza aminoacidica data. BlastX = data una sequenza nucleotidica, la traduce in tutte e sei le possibili cornici di lettura (traduzione dinamica), e cerca le seqeunze omologhe alle traduzioni in un database di sequenze aminoacidiche tBlastN = data una sequenza aminoacidica, la confronta con tutte le possibili traduzioni di un database di sequenze nucleotidiche. tBlastX = data una sequenza nucleotidica, confronta la sua traduzione dinamica con tutte le possibili traduzioni di un database di sequenze nucleotidiche.

17 ATA --------SSGGYRKGVTEAKLKVAINGFGRIGRNFLRCWHGRKDSPLDIIAIND-TGGV 99 ATB AQIIPKAVTTSTPVRGETVAKLKVAINGFGRIGRNFLRCWHGRKDSPLEVVVLND-SGGV 119 HS ----------------MG--KVKVGVNGFGRIGRLVTRAAF--NSGKVDIVAINDPFIDL 40 MM --------------------MVKVGVNGFGRIGRLVTRAAI--CSGKVEIVAINDPFIDL 38 XL --------------------MVKVGINGFGCIGRLVTRAAF--DSGKVQVVAINDPFIDL 38 DM --------------------MSKIGINGFGRIGRLVLRAAI--DKG-ANVVAVNDPFIDV 37 CE ----------------MS--KANVGINGFGRIGRLVLRAAV--EKDTVQVVAVNDPFITI 40 SP ----------------MA--IPKVGINGFGRIGRIVLRNAI--LTGKIQVVAVNDPFIDL 40 ATC ----------------MADKKIRIGINGFGRIGRLVARVVL--QRDDVELVAVNDPFITT 42 OS ----------------MG--KIKIGINGFGRIGRLVARVAL--QSEDVELVAVNDPFITT 40 SC --------------------MVRVAINGFGRIGRLVMRIAL--SRPNVEVVALNDPFITN 38 ECA -------------------MTIKVGINGFGRIGRIVFRAAQ--KRSDIEIVAIND-LLDA 38 HI -------------------MAIKIGINGFGRIGRIVFRAAQ--HRDDIEVVGIND-LIDV 38 ECC --------------------MSKVGINGFGRIGRLVLRRLL-EVKSNIDVVAIND-LTSP 38.:.:**** ***. * ::: :**. ATA KQASHLLKYDSTLGIFDADVKPSGETAISVD-----GKIIQVVSNRNPSLLPWKELGIDI 154 ATB KNASHLLKYDSMLGTFKAEVKIVDNETISVD-----GKLIKVVSNRDPLKLPWAELGIDI 174 HS NYMVYMFQYDSTHGKFHG-TVKAENGKLVIN-----GNPITIFQERDPSKIKWGDAGAEY 94 MM NYMVYMFQYDSTHGKFNG-TVKAENGKLVIN-----GKPITIFQERDPTNIKWGEAGAEY 92 XL DYMVYMFKYDSTHGRFKG-TVKAENGKLIIN-----DQVITVFQERDPSSIKWGDAGAVY 92 DM NYMVYLFKFDSTHGRFKG-TVAAEGGFLVVN-----GQKITVFSERDPANINWASAGAEY 91 CE DYMVYLFKYDSTHGQFKG-TVTYDGDFLIVQKDGKSSHKIKVFNSKDPAAIAWGSVKADF 99 SP DYMAYMFKYDSTHGRFEG-SVETKGGKLVID-----GHSIDVHNERDPANIKWSASGAEY 94 ATC EYMTYMFKYDSVHGQWKHNELKIKDEKTLLFG----EKPVTVFGIRNPEDIPWAEAGADY 98 OS DYMTYMFKYDTVHGQWKHSDIKIKDSKTLLLG----EKPVTVFGIRNPDEIPWAEAGAEY 96 SC DYAAYMFKYDSTHGRYAG-EVSHDDKHIIVD-----GKKIATYQERDPANLPWGSSNVDI 92 ECA DYMAYMLKYDSTHGRFDG-TVEVKDGHLIVN-----GKKIRVTAERDPANLKWDEVGVDV 92 HI EYMAYMLKYDSTHGRFDG-TVEVKDGNLVVN-----GKTIRVTAERDPANLNWGAIGVDI 92 ECC KILAYLLKHDSNYGPFPW-SVDFTEDSLIVD-----GKSIAVYAEKEAKNIPWKAKGAEI 92. ::::.*: * : : : : ::. : * Allineamento multiplo generato dal programma CLUSTALW

18 Caratteristiche di famiglie di proteine derivabili da allineamenti multipli: Profilo= rappresentazione numerica dell’allineamento che valuta: a)Quali residui sono presenti in ogni posizione e con quale frequenza. b)Presenza di residui assolutamente conservati. c)Presenza di eventuali gap. Dagli allineamenti multipli si possono costruire delle position-specific scoring tables (PSST), che riflettono la probabilità di trovare un certo aminoacido in ogni posizione.

19 Caratteristiche di famiglie di proteine derivabili da allineamenti multipli: Pattern= rappresentazione dell’allineamento che valuta unicamente la presenza di determinati residui per ogni posizione. [IV]-G-x-G-T-[LIVMF]-x(2)-[GS] Motivo= sequenza conservata di aminoacidi che conferisce una specifica funzione o struttura. Blocco= regione conservata di un allineamento multiplo priva di gaps.

20 Analisi di domini conservati PFAM: database di allineamenti multipli e HMMs http://pfam.wustl.edu/ http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/ ProfileScan: http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN HMMER: costruzione di HMMs e ricerca di database http://hmmer.wustl.edu/ BLOCKS: http://blocks.fhcrc.org/ CDD search: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi

21 Mutazioni e polimorfismi: OMIM e SNPs

22 Browsers genomici e genomica integrativa www.genome.ucsc.edu