Verso il futuro con l’ingegneria genetica

Presentazione sul tema: "Verso il futuro con l’ingegneria genetica"— Transcript della presentazione:

1 Verso il futuro con l’ingegneria genetica
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2 1. Mantenere le cellule competenti di E
1. Mantenere le cellule competenti di E.coli Ampicillina sensibili in ghiaccio, per un paio di minuti, prima dell’aggiunta del DNA plasmidico. Per ogni trasformazione batterica usare μl di cellule competenti.

3 2. Aggiungere 50 ng di DNA plasmidico (pGEX- KT con resistenza all’ampicillina) alle cellule e incubare in ghiaccio per 30min. Effettuare un controllo negativo senza aggiungere DNA plasmidico ai 50 μl di cellule.

4 3. Incubare le cellule a 42 °C per 40sec (shock termico) per far in modo di dilatare i pori della membrana e facilitare l’entrata del DNA plasmidico nella cellula batterica.

5 4. Incubare le cellule in ghiaccio per 2min in modo tale da richiudere i pori della membrana.

6 5. Aggiungere alle cellule batteriche 250 μl di LB fresco(senza antibiotico) e incubare in agitazione a 37 °C per 40min. Si fanno crescere le cellule su un terreno normale. Si effettua l’incubazione a 37 °C per 40min perché serve alle cellule per riprendersi dopo lo shock termico, iniziare un ciclo di replicazione e permettere l’espressione del gene per la resistenza all’ampicillina

7 6. Allestire delle piastre con il terreno LB agarizzato contenente
50 mg/mL di ampicillina. Mettere in piastra di LBagar+AMP volumi differenti di sospensione cellulare e cioè: - 5 μl di cellule trasformate - 10 μl di cellule trasformate - 50 μl di cellule trasformate - 100 μl di cellule trasformate Piastrare anche: - 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su piastre LBagar+AMP(controllo negativo) - 20 μl di cellule senza aggiunta di DNA plasmidico su piastre LB agar (controllo positivo: in assenza di ampicillina si verifica la crescita di E.coli e si valuta la qualità delle cellule competenti.

8 7. Distribuire le cellule sulla superficie del terreno usando una spatola sterile ad L.
8. Incubare a 37°C per 24 ore. 9. Osservare le piastre delle cellule trasformate seminate in LB agar + Amp e contare le colonie per poter calcolare l’efficienza di trasformazione. Osservare le piastre dei controlli.