I segnali cellula-cellula: ormoni e recettori

I segnali cellula-cellula: ormoni e recettori
Nessuna cellula vive isolata. Una complessa rete di comunicazione tra cellule regola crescita, maturazione, differenziamento, metabolismo, omeostasi di cellule che compongono tessuti ed organi. Le cellule bersaglio sono a volte cellule che producono altri ormoni. I recettori ormonali svolgono un ruolo essenziale nel mediare l'azione degli ormoni. L'azione degli ormoni é determinata da differenti meccanismi intracellulari. Gran parte del controllo della secrezione di ormoni dipende da meccanismi a feedback. Esiste una stretta relazione tra l'attività del sistema nervoso centrale e la secrezione di ormoni La fluorescenza citoplasmatica mostra il passaggio di un'onda di concentrazione elevata di calcio (Ca) attraverso un campo di astrociti. Quando colture confluenti di astrociti ippocampali sono stimolate dal neurotrasmettitore glutammato, ne risulta tra l'altro un aumento delCa libero citoplasmatico, aumento che ha andamento oscillatorio; infatti può prendere la forma di onde di incremento di Ca che si propagano tra le cellule a 20 m/s. Icambiamenti della concentrazione di Ca, misurati con l'indicatore di fluorescenza fluo-3, sono campionati a intervalli di 4 s. Le aree che superano un determinato valore-soglia di incremento in un dato tempo assumono un dato colore convenzionalf!, che si sovrappone all'immagine data dalla fluorescenza citoplasmatica di base. Ogni campionamento di 4 s corrisponde a un colore diverso, codificato in una sequenza temporale. Si può osservare un'onda che origina dall'area viola a sinistra del centro, si allarga verso il centro del campo in un'area azzurra e poi si irradia verso l'alto attraverso archi verdi, giallo, arancio e rosso. (Per gentileconcessione di Steohen Smith.) Nessuna cellula vive isolata. Una complessa rete di comunicazione tra cellule regola crescita, maturazione, differenziamento, metabolismo, omeostasi di cellule che compongono tessuti ed organi. Le cellule bersaglio sono a volte cellule che producono altri ormoni. I recettori ormonali svolgono un ruolo essenziale nel mediare l'azione degli ormoni. L'azione degli ormoni é determinata da differenti meccanismi intracellulari. Gran parte del controllo della secrezione di ormoni dipende da meccanismi a feedback. Esiste una stretta relazione tra l'attività del sistema nervoso centrale e la secrezione di ormoni. La fluorescenza citoplasmatica mostra il passaggio di un'onda di concentrazione elevata di calcio (Ca) attraverso un campo di astrociti. Quando colture confluenti di astrociti ippocampali sono stimolate dal neurotrasmettitore glutammato, ne risulta tra l'altro un aumento delCa libero citoplasmatico, aumento che ha andamento oscillatorio; infatti può prendere la forma di onde di incremento di Ca che si propagano tra le cellule a 20 m/s. I cambiamenti della concentrazione di Ca, misurati con l'indicatore di fluorescenza fluo-3, sono campionati a intervalli di 4 s. Le aree che superano un determinato valore-soglia di incremento in un dato tempo assumono un dato colore convenzionalf!, che si sovrappone all'immagine data dalla fluorescenza citoplasmatica di base. Ogni campionamento di 4 s corrisponde a un colore diverso, codificato in una sequenza temporale. Si può osservare un'onda che origina dall'area viola a sinistra del centro, si allarga verso il centro del campo in un'area azzurra e poi si irradia verso l'alto attraverso archi verdi, giallo, arancio e rosso. (Per gentileconcessione di Steohen Smith.) Relazioni tra sistema nervoso e sistema endocrino :1) entrambi sono dei sistemi di segnalazione; 2) operano secondo uno schema stimolo-risposta; 3) trasmettono segnali in alcuni casi precisi e localizzati in altri grossolani e disomogenei; 4) entrambi i sistemi sono cruciali affinché cellule altamente differenziate, tessuti e vari organi che costituiscono l'organismo possano funzionare in maniera coordinata.

Forme di segnalazione

Segnalazione endocrina e sinaptica a confronto
Caratteristiche comuni: 1) Secrezione nel torrente circolatorio 2) Genesi di potenziali elettrici e depolarizzazione 3) Peptidi prodotti da cellule endocrine possono agire da neurotrasmettitori 4) Neurotrasmettitori possono agire da ormoni; 5) Un singolo tipo cellulare può produrre sia neurotrasmettitori (es. amine biogene) che ormoni (peptidici) 6) Un singolo gene può determinare la produzione di 1 peptide neurotrasmettitore e di 1 peptide ormonale. Caratteristiche differenti

Recettori specifici mediano la risposta a segnali extracellulari
Figura 19.2 Alcuni ormoni si legano a recettori di superficie, altri a recettori all'interno della cellula. (a) Recettori di superficie. Gli ormoni peptidici e proteici, le prostaglandine, gli amminoacidi, l'epinefrina e i composti simili a essi si legano ai recettori posti sulla superficie delle cellule, determinando un aumento o una diminuzione della concentrazione citosolica di AMPc, di Ca2+ , di 1,2-diacilglicerolo, o di qualche altro secondo messaggero. (b) Recettori citosolici o nucleari. Gli steroidi, la tiroxina e l'acido retinoico, di natura molto idrofobica, sono trasportati da proteine ematiche. Dissociati dal trasportatore, gli ormoni penetrano nella cellula, si legano a recettori specifici nel citosol o nel nucleo e agiscono sul DNA nucleare, alterando la trascrizione di geni specifici. La > parte degli ormoni lipofilici interagisce con recettori citosolici o nucleari e altera l’espressione genica. Gli ormoni idrosolubili interagiscono con recettori sulla superficie cellulare La > parte delle molecole che inducono cambiamenti rapidi dell’attività cellulare sono idrosolubili e si legano a recettori localizzati a livello della membrana plasmatica. Altre molecole segnale alterano principalmente le modalità di espressione genica e sono generalmente liposolubili; esse inducono risposte più lente e più durature rispetto a quelle indotte da segnali idrosolubili. Uno degli esempi più noti di questa classe sono gli ormoni steroidei. I recettori proteici si trovano sulla superficie, nel citosol, nel nucleo delle cellule bersaglio. Esse sono dotate di un sito di legame ad alta affinità per un ormone, neurotrasmettitore, etc. Quando si ha il legame ligando-recettore si avvia una serie di reazioni che altera il funzionamento della cellula. Una cellula può avere più tipi di recettori; tipi di cellule diverse possono avere diversi recettori per lo stesso ligando che suscita risposte diverse; lo stesso recettore può essere presente in tipi di cellule diverse suscitando risposte diverse (es. recettori per acetilcolina su muscolo scheletrico e cellule miocardiche). In alcune cellule diversi complessi ormono-recettore inducono una risposta cellulare analoga. Es. in epatociti il glucagone e adrenalina legandosi ai propri recettori inducono degradazione di glicogeno e rilascio di glucosio nel sangue. L’unica funzione del ligando è quella di legarsi al recettore in quanto non viene metabolizzato per formare prodotti utili, non è intermedio di attività cellulari e non ha proprietà enzimatiche. Le cellule bersaglio spesso modificano o degradano il ligando e così facendo modificano o pongono fine alla risposta. Si possono classificare gli ormoni in 3 ampie categorie: 1) piccole molecole lipofile che diffondono attraverso la membrana plasmatica e interagiscono con recettori presenti nel citosol e nel nucleo; 2) molecole idrofiliche che si legano a recettori sulla superficie cellulare; 3) molecole lipofile che si legano a recettori della membrana plasmatica. La > parte degli ormoni lipofilici interagisce con recettori citosolici o nucleari e altera l’espressione genica. I rappresentanti più importanti che interagiscono con recettori intracellulari sono: steroidi; tiroxina e acido retinoico.

Ormoni steroidei. Precursore comune rappresentato dal colesterolo; ormoni secreti dalle ghiandole della riproduzione; corticosurre-nalici; metaboliti attivi della vitamina D. Progesterone Differenziamento dell'utero in preparazione all'impianto del embrione; mantenimento delle prime fasi della gravidanza, sviluppo del sistema alveolare delle ghiandole mammarie Ovaio, corpo luteo; placenta Differenziamento dell'utero e di altri organi sessuali femminili; mantenimento dei caratteri sessuali secondari della femmina e delle normali funzioni cicliche degli organi sessuali accessori; sviluppo del sistema duttale delle ghiandole mammarie Estradiolo Ovaio, placenta Testosterone Maturazione e normale funzionamento degli organi sessuali accessori maschili; sviluppo delle caratteristiche sessuali maschili Testicolo Cortisolo Effetto sul metabolismo dei carboidrati, dei lipidi e delle proteine; riduzione dell'infiammazione e delle risposte immunitarie; aumento delle risposte fisiologiche globali allo stress Corteccia surrenale Aldosterone Mantenimento del bilancio idrico e ionico; riassorbimento degli ioni da parte delle cellule epiteliali del rene

Amine ormone tiroideo, catecolamine (adrenalina, noradrenalina); precursore comune tirosina. Tetraiodiotironina (T4) Aumentata produzione di calore; mantenimento del metabolismo del glucosio e di altri «carburanti»; ampi effetti sull'espressione genica e sull'induzione di sintesi enzimatiche Tiroide Triidiotironina (T3) Aumento delle pulsazioni e della pressione sanguigna; contrazione della maggior parte dei muscoli lisci; glicogenolisi nel fegato e nel muscolo; idrolisi dei lipidi del tessuto adiposo Epinefrina Midolla surrenale Norepinefrina Contrazione delle arteriole; diminuzione della circolazione periferica. Le prostaglandine sono sostanze lipidiche, prodotte nella > parte dell’organismo che si legano a recettori posti sulla superficie della cellula. Contengono un anello di ciclo-pentano e sono sintetizzate a partire dall’acido arachidonico (ac grasso 20 atomi di carbonio). Esistono almeno 16 diverse prostaglandine appartenenti a 9 classi chimiche diverse denominate PGA, PGB, …., PGL. Sono sintetizzate e secrete di continuo e rapidamente degradate. Fungono da segnali paracrini. Mediano risposta di altri ormoni. Es: aggregazione piastrine e adesione; ruolo fondamentale nella coagulazione del sangue. Aspirina altri agenti ne inibiscono la sintesi. Contrazione della muscolatura liscia etc.. Mastociti Istamina Dilatazione dei piccoli vasi sanguigni Prostaglandine; derivati ac. arachidonico > Parte del corpo Contrazione del muscolo liscio

Proteine e peptidi Glucagone Peptide, 29 aacidi
Cellule alfa del pancreas Stimola la sintesi del glucosio e la degradazione del glicogeno nel fegato, l’idrolisi dei lipidi nel tessuto adiposo Insulina Polipeptide, catena A: 21 aacidi catena B: 30 aacidi Cellule beta del pancreas Stimola l'assunzione di glucosio nelle cellule adipose e muscolari e il meta-bolismo dei carboidrati; stimola la sintesi di lipidi da parte del tessuto adiposo e stimola in generale la sintesi proteica e la proliferazione cellulare Gastrina Polipeptide, 17 aacidi Intestino Secrezione di HCI e di pepsina da parte dello stomaco Secretina Polipeptide, 27 aacidi Intestino tenue Secrezione di enzimi digestivi pancrea Secrezione di enzimi digestivi pancreatici; svuotamento della cistifellea Colecistochinina Polipeptide, 23 aacidi Secrezione di enzimi digestivi pancreatici; svuotamento della cistifellea Ormone adreno corticotropo (ACTH) Polipeptide, 39 aacid Adenoipofisi Idrolisi su lipidi da parte del tessuto adiposo; stimola la corteccia surrenale a produrre cortisolo e aldosterone Ormone fol1icolo stimolante (FSH) Proteina, Catena alfa: 92 aacidi Catena beta : 118 aacidi Stimola la crescita degli oociti e dei follicoli ovarici e la sintesi di estrogeni da parte dei follicoli Ormone luteinizzante (LH) Proteina Catena beta: 115 aacidi Maturazione dell’oocita; stimola secrezione di estrogeni e di progesterone da parte dei follicoli ovarici Ormone tireostimolante (TSH) Catena beta: 112 aacidi Rilascio di tiroxina da parte delle cellule tiroidee Ormone paratiroideo Proteina, 84 aacidi Paratiroide Aumento del Ca2+ e diminuzione dei fosfati nel sangue; mobilizzazione dei fosfati di calcio dalle ossa; aumento del riassorbimento di calcio e diminuzione di riassorbimento di fosfato dal filtrato renale

Proteine e peptidi Fattori di crescita e differenziamento Vasopressina
Proteina, 9 aacidi Neuroipofisi Aumento dell’assorbimento di acqua dall’urina da parte dei tubuli renali; costrizione dei capillari sanguigni e aumento della pressione sanguigna Ormone di rilascio del TSH Polipeptide, 3 aacidi Ipotalamo Induce secrezione dell’ormone tiroido-stimolante da parte dell’adenoipofisi Ormone del rilascio dell’LH (LHRH) Polipeptide, 10 aacidi Ipotalamo, neuroni Induce secrezione dell’ormone luteinizzante da parte dell’adenoipofisi Fattore di crescita dell’epidermide (EGF) Polipeptide, 53 aacidi Ghiandole salivari e altre ghiandole Crescita delle cellule dell’epidermide e di altre cellule Somatotropina (GH) (ormone della crescita) Polipeptide, 191 aacidi Adenoipofisi Stimola l’assunzione di aacidi da parte di molte cellule; stimola il fegato a produrre IGF-1 che, a sua volta, induce la crescita delle ossa e dei muscoli Eritropoietina Polipeptidi, 166 aacidi Rene Differenziamento delle cellule staminali eritrocitarie Fattore stimolante le colonie granulocitiche e macrofagiche (GM-CSF) Polipeptidi di PM e 35000 Linfociti T, cellule endoteliali e fibroblasti Differenziamento di cellule staminali granulocitiche e macrofagiche Interleuchina-2 Polipeptide di PM 15500 Linfociti T e macrofagi Divisione dei linfociti T, nel sistema immunitario Fattore di crescita delle cellule nervose Fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1) 2 catene identiche di 118 aacidi Polipeptide, 70 aacidi Tutti i tessuti innervati da neuroni simpatici Fegato ed altre cellule Crescita e differenziamento dei neuroni sensori e simpatici Fattore di crescita autocrino/paracrino indotto da GH; stimola crescita e divisione cellulare e assunzione di glucosio e aacidi; fa aumentare sintesi di glicogeno nel fegato Fattori di crescita e differenziamento

Regolazione livelli ormonali
Risposte che durano secondi o minuti sono tipiche di ormoni peptidici o di catecolamine. Le cellule secretorie sono dotate di depositi. Ormoni peptidici come insulina e adrenocorticotropo sono secreti come peptidi più lunghi scisse poi da proteasi specifiche. Gli ormoni peptidici sopravvivono nel sangue solo pochi minuti o secondi prima di essere degradati da proteasi ematiche o tissutali. Le catecolamine vengono inattivate o internalizzate da cellule specifiche. Effetti su enzimi specifici sono anch’essi abbastanza brevi. L’ormone tireostimolante determina endocitosi della tireoglobulina e sua proteolisi a tiroxina. Gli steroidi derivano dal colesterolo. Le cellule che producono steroidi hanno riserve sufficienti solo per poche ore. Sintesi, liberazione e degradazione degli ormoni sono soggetti a regolazione. I livelli ormonali sono regolati da complessi circuiti di feedback. Ad esempio i livelli di estrogeni e progesterone nel sangue della femmina dei mammiferi. L'ormone ipofisario FSH induce il follicolo ovarico che si sta sviluppando a crescere e a secernere estrogeni, che stimolano la crescita dell'endometrio uterino. Gli estrogeni agiscono anche sull'ipotalamo per inibire la secrezione del fattore di rilascio del FSH(FSHRH) e direttamente sull'adenoipofisi per ridurre la secrezione di FSH, abbassando cosi la produzione di estrogeni (feedback negativo). Con l'avvicinarsi del follicolo alla maturazione, diminuisce la produzione di FSH. L'ipotalamo libera l'ormone di rilascio dell'ormone luteinizzante (LHRH). Esso induce l'adenoipofisi a secernere LH, che porta a completamento la maturazione del follicolo e dell'oocita.ll follicolo maturo libera l'oocita nell'ovidotto e viene trasformato in una ghiandola endocrina temporanea, il corpo luteo. Sotto la continua stimolazione del LH, il corpo luteo produce progesterone che, a sua volta, determina l'ulteriore accrescimento della parete uterina, preparandola a ricevere un embrione. Se si verificano la fecondazione e l'impianto, i tessuti placentali producono la gonadotropina corionica, (CG), un ormone peptidico la cui struttura e funzione sono simili a quelle del LH. La gonadotropina corionica impedisce che il corpo luteo degeneri; in particolare, mantiene la sintesi continua di progesterone (feed-back positivo). Il progesterone, a sua volta, mantiene le cellule dell'endometrio, che riveste la cavità uterina, e si forma un buon sistema di irrorazione sanguigna per nutrire l'embrione impiantato. Sintesi, liberazione e degradazione degli ormoni sono soggetti a regolazione I livelli ormonali sono regolati da complessi circuiti di feedback

Meccanismo di azione degli ormoni
I modello: ormoni steroidei, tiroidei, acido retinoico II modello: ormoni proteici e catecolammine Figura Modello di attivazione dei geni a opera di un ormone solubile nei lipidi della membrana cellulare; esso entra nella cellula per diffusione. Il recettore ormonale si trova complessato con un inibitore, che si distacca dopo l'interazione ormone-recettore. All'ormone si lega a1 dimero del recettore, che è di natura proteica; il complesso penetra nel nucleo e si associa agli elementi di risposta a livello del DNA, attivando in questo modo la trascrizione del relativo gene. Dopo aver attraversato la membrana plasmatica gli steroidi interagiscono con i recettori proteici situati nel nucleo o nel citosol e vanno così a formare complessi che si accumulano nel nucleo; qui si legano a sequenze di DNA specifiche con funzione di regolazione e fanno aumentare o diminuire il tasso di trascrizione dei geni adiacenti. Tali complessi possono anche influire sulla stabilità di specifici mRNA. Sono efficaci per tempi relativamente lunghi (ore o giorni). Spesso influenzano la crescita o il differenziamento di tessuti specifici. Ormoni proteici e catecolammine interagiscono con recettori di superficie. Questa categoria comprende grandi polipeptidi, come l’insulina, il GH ed il glucagone e le catecolamine. Gli effetti di tali ormoni sono di solito immediati e di durata molto breve: i tempi di reazione della cellula sono dell’ordine dei millisecondi o al massimo di pochi secondi. In genere questi recettori si avvalgono di messaggeri intracellulari come l’AMPc ed il calcio che sono i maggiori rappresentanti. Gli effetti di fattori di crescita che inducono variazioni dell’espressione genica in pochi minuti si protraggono per giorni e sono necessari per la crescita ed il differenziamento cellulare. Gli ormoni idrosolubili interagiscono con recettori della superficie cellulare con effetti immediati. I fattori di crescita peptidici inducono variazioni espressione genica La > parte degli ormoni lipofili interagisce con recettori citosolici o nucleari e altera l’espressione genica con effetti duraturi (ore o giorni)

1) Meccanismo di azione ormoni steroidei e tiroidei: Superfamiglia
dei recettori intracellulari Gli ormoni steroidei liposolubili attraversano la membrana e diffondono nel citoplasma dove si legano ai recettori specifici ed insieme entrano nel nucleo. Esperimenti fatti con anticorpi, hanno dimostrato che inizialmente il recettore è localizzato nel citoplasma dove fa parte di un aggregato proteico con l’inibitore (heat shock protein). Dopo il legame con l’ormone, il recettore si trova essenzialmente nel nucleo. La formazione del fattore di trascrizione attivo richiede quindi il legame con l’ormone che determina la rimozione dell’inibitore del complesso proteico-inibitore con la esposizione del sito che lega il DNA. Il primo recettore per il quale si ottenne un elevato grado di purificazione era specifico per i glucocorticoidi. Con le tecniche di genetica molecolare è stato possibile ottenere i cloni per glucocorticoidi, ormone tiroideo, vitamina D, acido retinoico Con microscopio elettronico è stato evidenziato il legame dei complessi recettore-ormone che si legano in più siti in regioni da qualche centinaio di nucleotidi a monte del segnale di inizio della sintesi del RNA. Il confronto tra le sequenze dei recettori dimostra che questi appartengono ad 1 superfamiglia che ha 1 dominio ammino-terminale variabile tra aacidi, non conservato tra i vari recettori; 1 nucleo centrale di circa 68 aacidi altamente conservato (più del 40% di identità di sequenza tra i recettori diversi). In questa regione centrale ve ne è 1 ricca in aacidi basici ed 1 ricca in cisteina, costituendo un dominio a dita di zinco. Il dominio che lega le molecole di effettore è all’estremità carbossi-terminale. I vari recettori per gli ormoni steroidei non sono presenti uniformemente in varie cellule. I recettori per l’ormone tiroideo che sono almeno 2 non sono rappresentati nella stessa misura nelle diverse cellule.

2) Meccanismo di azione ormoni steroidei e tiroidei: Elementi di risposta
Figura Legame del recettore per il glucocorticoide alle sequenze del promotore del virus per il tumore mammario di topo (MMTV). (a) Disegno della regione del genoma dell'MMTV che contiene i siti di legame per il recettore del glucocorticoide e il sito di inizio (+ 1) per la sintesi di RNA dipendente dall'ormone. (b) Fotografia al microscopio elettronico dei complessi formati dal recettore per i glucocorticoidi e l’ormone e legati al DNA schematizzato in (a). Il recettore, una proteina, forma probabilmente dei tetrameri. (c) Footprint dopo trattamento con DNasi della regione del promotore del genoma deII'MMTV, in presenza e in assenza del recettore per i glucocorticoidi, che protegge quattro regioni (barrette rosse) dalla digestione con DNasi. Nelle corsie da 2 a 5 sono presenti concentrazioni crescenti di recettore per i glucocorticoidi, che non sono presenti nella corsia 1. I numeri indicano le posizioni dei nucleotidi a monte dal sito di inizio. (Da F. Payvar, et al., 1983, CelI, 35, D. 391.; fotografie per gentile concessione di K. Yamamoto.J Una volta entrato nel nucleo il complesso ormone recettore si lega al DNA. Si conoscono i siti di legame al DNA caratteristici per tutti i principali recettori degli ormoni steroidei (Elementi di risposta) che sono lunghi 15 basi circa e presentano una simmetria a diade (costituiti da tratti ripetuti e invertiti imperfetti suggerendo che i recettori potrebbero legarsi sotto forma di dimeri a tali siti. Esperimenti di footprint con la DNAasi hanno dimostrato che i complessi recettore -ormone glucocorticoide si legano a 4-6 siti di di DNA di un frammento di 1,2 kb del genoma del virus di un tumore mammario di topo (MMTV), la cui trascrizione aumenta in presenza di glucocorticoidi. Il legame avviene ad una distanza di nucleotidi a monte del segnale di inizio per la sintesi del RNA. Il legame tra il recettore ed il DNA avviene tramite delle regioni a dita di zinco, possedute dai rrecettori degli ormoni steroidei e tiroidei e da dozzine di altre proteine di regolazione che sono caratterizzate dalla ripetizione di 9 domini che contengono cisteine e istidine ad intervalli regolari. La proteina purificata è associata allo zinco, che è necessario alla sua attività. Nella struttura ripiegata dotata di dita di zinco i domini che si ripetono formano anse in maniera che 1 ione zinco sia legato tra una coppia di cisteina e 1 coppia di istidine. Nelle anse troviamo in posizioni quasi costanti, 1 residuo di fenilalanina (F) o di tirosina (y) e 1 residuo di leucina (L) che sono necessari al legame con il DNA. I pallini neri indicano le catene laterali che con maggior probabilità sono impegnate in legami con il DNA. I recettori degli ormoni steroidei posseggono regioni a dita di zinco con cui si legano al DNA Figura Ipotesi di struttura ad ansa con dita di zinco per i domini ripetuti del TFIIIA, risultante dal legame di coordinazione delle cisteine (C) e delle istidine (H) invarianti con uno ione di zinco (Zn). La figura mostra solo le prime due delle nove anse possibili. I numeri a fianco dei codici a singola lettera per gli amminoacidi indicano le distanze in numero di residui amminoacidici (Figura 11.12). I pallini neri indicano le catene laterali che con maggior probabilità sono impegnate in legami con il DNA. In ogni ansa si trovano sempre una leucina (L) invariante e una tirosina (y) o una fenilalanina (F). (Adattata da l. Miller, A.D. McLachlan, 1985, EMBO J.)

Regolazione della trascrizione genica
Figura Controllo della trascrizione. A. Un tipico gene eucariota è costituito da due regioni, la regione codifìcante, che viene trascritta dalla RNA polimerasi Il nell'RNA messaggero e quindi tradotta in proteine specifiche, e una regione regolatrice, che comprende alcuni elementi intensifìcatori e un elemento promotore, che regola ['inizio della trascrizione del gene strutturale. B. Le proteine che regolano la trascrizione si legano sia alla regione del promotore che a quella dell'intensificatore. 1) Jn gruppo di proteine si lega alla TATA-box, al promotore e alla regione distale dell'intensificatore. 2. Le proteine che si legano alla regione dell'intensificatore determinano un ripiegamento ad ansa del DNA, che permette alle proteine regolatrici legate alla regione distale dell'intensificatore di entrare in contatto con la polimerasi , I recettori steroidei regolano la velocità della trascrizione genica. Le sequenze geniche che fungono da stampo per la trascrizione comprendono due regioni: 1 codificante e 1 regolatrice. La regione regolatrice è posta a monte di quella codificante. La regione regolatrice a sua volta comprende 2 diversi tipi di controllo. Il primo o elemento prossimale è detto regione del promotore. In molti geni questo elemento è una sequenza di otto coppie di basi, detta TATA-box poiché ricca di adenina e timina ed è circondata da guanina e citosina (G e C), localizzata circa 30 coppie di basi a monte rispetto al punto di inizio della trascrizione. La TATA box ha la funzione di far assumere al RNA-polimerasi l’esatta posizione dalla quale deve partire la trascrizione; negli eucarioti l’RNA polimerasi si lega alle proteine del TATA-box. Il secondo elemento di controllo o distale è rappresentato dalla zona del DNA detta regione dell’intensificatore localizzato ad una distanza variabile di poche centinaia di coppie di basi sino a 100 kilobasi dall’elemento promotore. Gli elementi dell’intensificatore 7-20 paia di basi sono detti elementi di risposta. L’elemento di risposta a AMPc (CRE) consiste dalla sequenza ACGTCA e riconosce proteine leganti (CREB) attivate da processi di fosforilazione controllati da protein-chinasi AMPc-dipendente. L’elemento di risposta al siero o estere del forbolo (SRE o PRE) ha sequenza TGACTCAG. Elemento di risposta ai glicocorticoidi (GRE) riconosce il recettore proteico di tali ormoni. Affinchè gli ormoni possano esercitare il loro effetto è indispensabile che gli elementi regolatori si leghino con le proteine del promotore (fattori del TATA-box ) si leghino con l’intensificatore. Poiché le regioni del promotore e dell’intensificatore sono molto distanti è stato ipotizzato che le sequenze del DNA si ripieghino ad ansa in modo da che le proteine regolatrici legate all’intensificatore si leghino a quelle prossimali del promotore. Fattori di trascrizione come ad esempio il recettore degli ormoni steroidei posseggono: una regione di legame con il DNA (dita di zinco); una regione attivatrice con carattere acido che entra in contatto con i fattori di trascrizione; una o più regioni di legame per i ligandi o siti di fosforilazione necessari per attivare i fattori di trascrizione. La maggior parte delle regioni di legame con il DNA appartengono a 1 di queste 3 famiglie: 1) Proteine elica-giro-elica costituite da catene polipeptidiche che contengono almeno due tratti con struttura ad alfa-elica; 2) Proteine a dita di zinco; 3) Proteine anfipatiche ad elica: comprendono 2 tipi di sottostrutture, proteine elica-ansa-elica e proteine a cerniera di leucina. Queste 3 classi di proteine regolatrici della trascrizione formano dimeri che possono legarsi tra loro o con il DNA. E’ possibile la formazione di eterodimeri le quali possono legarsi a sequenze diverse di DNA regolando in tal modo l’attività di geni bersaglio diversi in molteplici combinazioni. Un numero limitato di proteine regolatrici è in grado di esercitare un numero molto elevato di interazioni regolatrici sul processo di trascrizione Un numero limitato di proteine regolatrici è in grado di esercitare un numero molto elevato di interazioni regolatrici sul processo di trascrizione

Meccanismo d’azione degli ormoni idrosolubili: recettori di superficie
Figura 19.3 Tipi di recettori di superficie. (a) Canali ionici attivati dal calcio. Il ligando induce nel recettore, associandosi a esso, una variazione conformazionale, che apre nella proteina stessa un canale ionico specifico. Ne consegue un flusso di ioni, che altera la differenza di potenziale elettrico tra i due lati della membrana. (b) Proteina chinasi attivata dal ligando. La formazione del legame recettore-ligando induce un'attività proteina-chinasica; il recettore fosforila una proteina substrato e, così facendo, ne altera l' attività. (c) Proteina fosfatasi di residui tirosinici attivata dal ligando. II ligando induce nel recettore l'attivazione di un'attività fosfatasica, che rimuove un residuo fosforico legato a una tiroxina di una proteina substrato. L'attività di tale proteina ne è di conseguenza alterata. (d) Guanilato ciclasi attivata dal ligando. Questo, legandosi, attiva la sintesi nel citosol del secondo messaggero GMP 3',5‘ ciclico a partire da GTP. (e) Attivazione indotta dal ligando di una proteina G e generazione di un secondo messaggero. Il legame del ligando attiva una proteina G che si lega, attivandolo, a un enzima, che genera un secondo messaggero intracellulare specifico. Secondi messaggeri Molti recettori di superficie il legame con il ligando attiva un’enzima che genera un incremento di breve durata nella concentrazione del secondo messaggero intracellulare. Tra i secondi messaggeri si annoverano AMP 3’, 5’ ciclico (cAMP), il GMP 3’, 5’ ciclico (cGMP), 1,2-diacilglicerolo, inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) ed il Ca2+. Un primo caso è un’attivazione indotta dal ligando di una proteina G e generazione di un secondo messaggero. Il legame del ligando attiva una proteina G che si lega, attivandolo, a un enzima, che genera un secondo messaggero intracellulare specifico. La guanilato ciclasi è attivata direttamente dal legame con il ligando senza l’intervento di una proteina G. Questo, legandosi, attiva la sintesi nel citosol del secondo messaggero GMP 3',5‘ ciclico a partire da GTP. L’elevata concentrazione intracellulare di 1 o più di questi II messaggeri determina rapida alterazione dell’attività di 1 o più enzimi o altre proteine. La rimozione o degradazione del ligando riduce il livello del secondo messagero e pone fine alla risposta metabolica. Recettori per insulina (B) agiscono direttamente fosforilando proteine substrato e in tal modo modificandone l’attività. La loro attività protein- chinasi è attivate dal legame recettore-ligando. Altri recettori sono fosfatasi proteiche di residui tirosinici la cui attivazione è indotta ancora una volta dal ligando. Ciò porta alla rimozione di residuo fosforico legato a una tiroxina di una proteina substrato. (A) Recettori canale ionici attivati dal calcio. Il ligando induce nel recettore, associandosi a esso, una variazione conformazionale, che apre nella proteina stessa un canale ionico specifico. Ne consegue un flusso di ioni, che altera la differenza di potenziale elettrico tra i due lati della membrana. Tali recettori-canale si trovano in particolare nel sistema nervoso. Una menzione particolare meritano le prostaglandine che pur essendo lipofiliche si legano a recettori di superficie. Non tutti i recettori di superficie utilizzano il secondo messaggero intracellulare

Recettori di superficie accoppiati a proteine G
Figura 14-2 Schema generale delle vie di secondo messaggero. Finora sono state identificate soltanto alcune delle vie attraverso le quali può aver luogo la trasduzione dei segnali.Le tre vie rappresentate nella figura comportano una serie di passaggi analoghi (a sinistra). Gli ormoni entrano in contatto con molecole recettrici della membrana plasmatica ed attivano una famiglia di proteine trasduttrici strettamente imparentate fra loro e capaci di attivare enzimi che fungono da effettori primari. Questi enzimi danno origine alla formazione di un secondo messaggero, che può attivare un effettore secondario o agire direttamente su proteine bersaglio (regolatrici). La prima delle vie rappresentate dà origine al secondo messaggero AMPc che viene prodotto dall'adenil-ciclasi attivata da una proteina-G (il nome dipende dal fatto che queste proteine sono attive soltanto in presenza di guanosin trifosfato (GTP). La proteina-G rappresentata viene detta G, in quanto stimola la ciclasi. Alcuni recettori attivano un'altra proteina, Gi, che inibisce la ciclasi. La seconda via è attivata da un recettore muscarinico per l' ACh ed impiega un'altra proteina-G (G) per attivare la fosfolipasi C (PLC). L'enzima dà origine a una coppia di secondi messaggeri, il DAG e l'IP3. L'IP3 a sua volta, mobilizza Ca2+ dai depositi intracellulari. Il DAG attiva la protein-chinasi C (PKC). Il terzo principale sistema rappresentato attiva una cascata di reazioni enzimatiche che modificano l'acido arachidonico attraverso la fosfolipasi A2 (PLA2). Tre importanti enzimi che si formano in questa cascata di reazioni sono: la 5- e la 12-lipossigenasi e la ciclossigenasi. Figura 14-3 La struttura dei recettori accoppiati a proteire G è caratterizzata dalla presenza di sette segmenti di catena polipeptidica che attraversano la membrana a tutto spessore. La struttura del recettore 1-adrenergico è analoga a quella del recettore 2-adrenergico, del recettore muscarinico per l' ACh e della rodopsina. Una caratteristica strutturale importante di questi recettori è rappresentata dal sito di legame per il neurotrasmettitore che è localizzato sulla superficie extracellulare della cellula, appena ricoperto dalla matrice lipidica della membrana (nell'esempio, il sito è rappresentato dal residuo 113 di un aspartato). La parte del recetto re colorata in marrone è quella con cui prende rapporto la proteina-G. I due residui di serina, raffigurati in nero indicano i siti dove avviene la fosforilazione. (Modificata, da Frielle e collaboratori, 1989.) Recettore a sette eliche Schema generale delle vie di secondo messaggero. Finora sono state identificate soltanto alcune delle vie attraverso le quali può aver luogo la trasduzione dei segnali.Le tre vie rappresentate nella figura comportano una serie di passaggi analoghi (a sinistra). I neurotrasmettitori entrano in contatto con moletole recettrici della membrana plasmatica ed attivano una famiglia di proteine trasduttrici strettamente imparentate fra loro e capaci di attivare enzimi che fungono da effettori primari. Questi enzimi danno origine alla formazione di un secondo messaggero, che può attivare un effettore secondario o agire direttamente su proteine bersaglio (regolatrici). La prima delle vie rappresentate dà origine al secondo messaggero AMPc che viene prodotto dall'adenilil-ciclasi attivata da una proteina-G (il nome dipende dal fatto che queste proteine sono attive soltanto in presenza di guanosin trifosfato (GTP). La proteina-G rappresentata viene detta G, in quanto stimola la ciclasi. Alcuni recettori attivano un'altra proteina, GI, che inibisce la ciclasi. La seconda via è attivata da un recettore muscarinico per l' ACh ed impiega un'altra proteina-G (G) per attivare la fosfolipasi C (PLC). L'enzima dà origine a una coppia di secondi messaggeri, il DAG e l'IP 3. L'IP3 a sua volta, mobilizza Ca2+ dai depositi intracellulari. Il DAG attiva la protein-chinasi C (PKC). Il terzo principale sistema rappresentato attiva una cascata di reazioni enzimatiche che modificano l'acido arachidonico attraverso la fosfolipasi A2 (PLA2). Tre importanti enzimi che si formano in questa cascata di reazioni sono: la 5- e la 12-lipossigenasi e la ciclossigenasi. Struttura dei recettori accoppiati a proteine G. La struttura dei recettori accoppiati a proteine G è caratterizzata dalla presenza di sette segmenti di catena polipeptidica che attraversano la membrana a tutto spessore. La struttura del recettore 1-adrenergico è analoga a quella del recettore 2-adrenergico, del recettore muscarinico per l' ACh e della rodopsina. Una caratteristica strutturale importante di questi recettori è rappresentata dal sito di legame per l’ormone che è localizzato sulla superficie extracellulare della cellula, appena ricoperto dalla matrice lipidica della membrana (nell'esempio, il sito è rappresentato dal residuo 113 di un aspartato). La parte del recetto re colorata in marrone è quella con cui prende rapporto la proteina-G. I due residui di serina, raffigurati in nero indicano i siti dove avviene la fosforilazione. (Modificata, da Frielle e collaboratori, 1989.) Le diverse vie di secondo messaggero hanno molte caratteristiche comuni

Sistema dell’AMPciclico
Tessuto Ormone che aumenta cAMP Risposta metabolica Adiposo Adrenalina; ACTH; glucagone > idrolisi trigliceridi; < assunzione di amminoacidi Fegato Adrenalina; noradrenalina; glucagone > glicogenolisi; < sintesi di glicogeno; > assunzione di amminoacidi; > gluconeogenesi Follicolo ovarico FSH; LH > sintesi di estrogeni e progesterone Corteccia surrenale ACTH > sintesi di aldosterone e cortisolo Cellule muscolari cardiache Adrenalina > ritmo di contrazione Tiroide TSH Secrezione della tiroxina Cellule ossee Ormone paratiroideo > riassorbimento del calcio dall'osso Muscolo scheletrico Conversione del glicogeno a glucosio Intestino Secrezione di fluidi Rene Vasopressina Riassorbimento dell'acqua Piastrine del sangue Prostaglandina I < aggregazione e secrezione ; Sintesi e degradazione dell’AMPc AMP ciclico E' stato per la prima volta identificato come mediatore intracellulare dell'azione ormonale nel I recettori beta-adrenergici per l’adrenalina agiscono tramite AMPc. Esistono agonisti (isoprotenerolo) che imitano la funzione ormonale ed altre sostanze gli antagonisti (propanololo; practololo) che si legano al recettore senza attivare le funzioni svolte dagli ormoni. Esistono diversi tipi di recettore beta-adrenergico. Nell’uomo I recettori 1 delle cellule miocardiche aumentano il ritmo cardiaco e contrattilità. I recettori 2 delle cellule della muscolatura liscia dei bronchi mediano la distenzione cellulare. L’AMPciclico è prodotto dall’adenilato ciclasi, un’enzima legato alla membrana con il sito di legame per l’ATP rivolto all’esterno. Il sito di legame tra recettore ed ormone è localizzato sulla faccia esterna. La proteina G si trova legata sulla faccia citoplasmatica è l’agente di comunicazione tre recettore e adenilato ciclasi. Il livello di AMPc è di solito controllato dall’attivazione dell’adenilato ciclasi, viene anche regolato dalla sua degradazione ad opera della cAMP fosfodiesterasi che pone fine agli effetti della stimolazione ormonale. Molte cAMP fosfodiesterasi sono attivate da aumenti del calcio citosolico il quale si lega alla calmodulina ed il complesso calcio-calmodulina si lega a sua volta alla cAMP fosfodiesterasi attivandola e di conseguenza aumentando l’idrolisi di cAMP.

Attivazione dell’adenilato ciclasi
.Figura L'attivazione dell'adenilato ciclasi operata dal legame di un ormone al suo recettore. Il tratto di membrana cellulare disegnato contiene due proteine transmembrana, un recettore proteico per un ormone (R ) , l'adenilato ciclasi (C) e, sul versante citosolico, la proteina di trasduzione Gs . Allo stato di riposo, GS., subunità di Gs, è associata a GDP. Quando un ormone si lega a esso, R subisce una variazione conformazionale (fase 1). R, allo stato attivato, si lega a Gs (fase 2). Questo attiva GS che rilascia GDP e lega GTP; il che causa la dissociazione della subunità GS,. dalle subunità G, (fase 3). La subunità GS,.libera si lega a C, attivandola, in modo che essa inizi a catalizzare la formazione di cAMP a partire da ATP (fase 4); questo passaggio può comportare una variazione conformazionale di G. Ache il GTP viene idrolizzato a GDP, reazione che con ogni probabilità è catalizzata dalla stessa GS  . GS  perde la capacità di attivare C (fase 5) e C e GS  e G, si riassociano. In seguito, l'ormone si dissocia dal recettore e l'ormone torna allo stato di riposo. Figura la proteina G si associa in maniera ciclica a GTP e a CDP; tale associazione è accoppiata all'attivazione e all'inattivazione dell'adenilato ciclasi. Si ritiene che la subunità GS stessa catalizzi l'idrolisi del GTP a GDP. La proteina G passa reversibilmente da una forma attiva a una quiescente e viceversa. Figura Diverse proteine G mediano l'attivazione e l'inibizione dell'adenilato ciclasi. Numerosi complessi ormone-recettore si legano a una proteina stimolante GS determinando la sostituzione del GDP precedentemente legato con GTP e la dissociazione della subunità GS  GTP, che va a legarsi con I'adenilato ciclasi e ad attivarla. Altri complessi ormone-recettore si legano a una proteina G diversa, con funzione inibente, Gi , costituita anch'essa da una subunità  che lega il GDP o il GTP e dalla subunità G, . In qualche modo, la proteina inibente Gi viene modificata, dopo di che lega l’adenilato ciclasi e la inibisce. Nei due tipi di proteine G, stimolanti e inibenti, le subunità G, sono uguali, mentre le subunità G e i recettori differiscono. La proteina GS lega il GTP in maniera non covalente ma efficacemente. GS è composta tra 3 catene polipeptidiche alfa, beta, gamma con P.M , , Da. Fino ad oggi sono stati identificati almeno 20 differenti geni che codificano la sintesi della sub-unità alfa; 4 la sub-unità beta e 7 quella gamma. La specificità della proteina G trimerica è determinata principalmente dalla sua sub-unità alfa. La sub-unità alfa lega GTP e GDP e si lega sia al recettore che all’adenilato ciclasi che non interagiscono direttamente tra loro. L'attivazione dell'adenilato ciclasi è operata dal legame di un ormone al suo recettore. Il tratto di membrana cellulare disegnato contiene due proteine transmembrana, un recettore proteico per un ormone (R ) , l'adenilato ciclasi (C) e, sul versante citosolico, la proteina di trasduzione Gs . Allo stato di riposo, GS., subunità di Gs, è associata a GDP. Quando un ormone si lega a esso, R subisce una variazione conformazionale (fase 1). R, allo stato attivato, si lega a Gs (fase 2). Questo attiva GS che rilascia GDP e lega GTP; il che causa la dissociazione della subunità GS,. dalle subunità G, (fase 3). La subunità GS,.libera si lega a C, attivandola, in modo che essa inizi a catalizzare la formazione di cAMP a partire da ATP (fase 4); questo passaggio può comportare una variazione conformazionale di G. Ache il GTP viene idrolizzato a GDP, reazione che con ogni probabilità è catalizzata dalla stessa GS. GS perde la capacità di attivare C (fase 5) e C e GS e G, si riassociano. In seguito, l'ormone si dissocia dal recettore e il recettore torna allo stato di riposo. In una cellula non stimolata la > parte delle molecole GS contiene GDP. La proteina G si associa in maniera ciclica a GTP e a GDP; tale associazione è accoppiata all'attivazione e all'inattivazione dell'adenilato ciclasi che è di conseguenza di breve durata (pochi secondi). Si ritiene che la subunità GS stessa catalizzi l'idrolisi del GTP a GDP. Le interazioni complesse tra recettore, proteina G e adenilato ciclasi hanno un ruolo importante nell’amplificare il segnale poiché un singolo complesso recettore-ormone può convertire sino a 100 complessi GS GDP G,Ognuno di questi complessi attiva 1 singola adenilato ciclasi. Diverse proteine G mediano l'attivazione e l'inibizione dell'adenilato ciclasi. Numerosi complessi ormone-recettore si legano a una proteina stimolante GS determinando la sostituzione del GDP precedentemente legato con GTP e la dissociazione della subunità GS  GTP, che va a legarsi con I'adenilato ciclasi e ad attivarla. Altri complessi ormone-recettore si legano a una proteina G diversa, con funzione inibente, Gi , costituita anch'essa da una subunità  che lega il GDP o il GTP e dalla subunità G, . In qualche modo, la proteina inibente Gi viene modificata, dopo di che lega l’adenilato ciclasi e la inibisce. Nei due tipi di proteine G, stimolanti e inibenti, le subunità G, sono uguali, mentre le subunità G e i recettori differiscono. La conferma del ciclo del GTP venne dallo studio dei meccanismi d’azione di alcune tossine batteriche. In particolare la funzione della tossina colerica fu la prima ad essere chiarita. Tale tossina consiste in 2 catene,1 delle quali è un’enzima il quale catalizza l’addizzione covalente di un gruppo ADP-ribosio alla sub-unità alfa della GS. Questa sub-unità modificata irreversibilmente puà attivare l’adenilato ciclasi ma non può idrolizzare il GTP, restando costantemente attiva e di conseguenza attivando permanentemente l’adenilato ciclasi. Nelle cellule intestinali l’incremento di AMPc nel citosol è di circa 100 volte. La tossina della pertosse aggiunge ADP-ribosio alla sub-unità alfa della Gi. In tal caso Gi non è in grado di inattivare l’adenilato ciclasi Esistono proteine G attivatrici ed inibitrici

Proteine G Monomeriche Eterotrimeriche GS Golf Gtl (bastoncelli)
Sottoclassi Effetti cellulari Proteine Ras simil Controllo della crescita e della differenziazione Proteine Rho simili (incluse le Rac) Controllo della polimerizzazione dei filamenti di actina e del loro assemblaggio in strutture specifiche come le adesioni focali Proteine Rab simili Controllo del movimento delle vescicole (mediante specificazione delle membrane bersaglio) Proteine ARFsimili Regolazione dell'assemblaggio e del disassemblaggio delle proteine di rivestimento delle vescicole (e, pertanto, del movimento delle vescicole) Proteina G Attivata dai recettori per Effettori Vie di segnalazione GS Catecolammine istarnina, glucagone, ACTH, LH, FSH, TSH etc. Adenilato ciclasi Canali del Ca++ AMPc > Ingresso diCa++ Golf Molecole odoranti > AMPc (olfatto ) Gtl (bastoncelli) Fotoni, Fosfodiesterasi del GMPc < GMPc (visione) Gt2 (coni) Fotoni < GMPc (visione dei colori) Gil Gi2 Gi3 Noradrenalina, prostaglandine, oppiati angiotensina, numerosi peptidi Fosfolipasi C Fosfolipasi A2 Canali del K+ < AMPc IP3, diacilglicerolo, Ca++ Liberazione di arachedonato Gq Acetilcolina, adrenalina Fosfolipasi C Polarizzazione della membrana Figura 5-7 Il ciclo di attività di una proteina G monomerica di tipo Ras. Altre proteine G monomeriche hanno cicli simili. L' attivazione della Ras è 5timolata da una GNRP (proteina che libera nucleotidi guaninici), che promuove il legame di GTP e la liberazione di GDP e, pertanto, l'attivazione della proteina G monomerica. L 'inattivazione della Ras è, invece, promossa da una GAP (proteina attivatrice della GTPasi), che stimola l'idrolisi del GTP legato. Oltre alle proteine G eterotrimeriche che come detto intervengono in una serie di vie di trasduzione del segnale, le più conosciute sono riportate nella tabella riportata nel lucido, esistono proteine G monomeriche a basso PM = dalton. I ruoli più importanti prevedono allungamento catene polipeptidiche nella sintesi proteica, proliferazione e differenziazione cellulare e loro trasformazione neoplastica, controllo del citoscheletro actinico e suoi legami con la matrice extracellulare, il trasporto delle vescicole e secrezione tramite esocitosi. Hanno un ciclo di attivazione e disattivazione simile a quello riportato per le proteine G eterotrimeriche; in questo caso però intervengono proteine regolatrici che non sono attive nel caso delle proteine G eterotrimeriche. In figura è illustrato il ciclo di attività di una proteina G monomerica di tipo Ras. Altre proteine G monomeriche hanno cicli simili. L' attivazione della Ras è stimolata da una GNRP (proteina che libera nucleotidi guaninici), che promuove il legame di GTP e la liberazione di GDP e, pertanto, l'attivazione della proteina G monomerica. L 'inattivazione della Ras è, invece, promossa da una GAP (proteina attivatrice della GTPasi), che stimola l'idrolisi del GTP legato. Di conseguenza l’attivazione e l’inattivazione delle proteine G monomeriche sono controllate da segnali che a loro volta influenzano l’attività di GNRP e GAP piuttosto che effetti sulla proteina G monomerica. Modificata da Bourne HR, Sanders DA, McConnick F: Nature 348:125, 1990

Protein chinasi A dipendente da AMPc
.Figura 5.8 Attivazione della proteina chinasi dipendente dall' AM Pc. Le due subunità regolatrici (subunità R) del complesso R2C2 sono legate da due ponti disolfuro. Il legame di due molecole di AMPc a ogni subunità R provoca la flessione di ogni subunità R nella regione cerniera e la liberazione delle due subunità catalitiche (C). (Elaborato da Taylor S: J Biol Chem 264:8443, 1989.) Figura 5-9 La famiglia delle proteine chinasi. Tutte le proteine chinasi conosciute possiedono un nucleo catalitico comune (regione colorata) che contiene sia i domini dell' ATP e del legame del peptide sia il sito attivo nel quale si verifica il trasferimento del fosforo. I residui conservati sono stati allineati sulla lisina 72 (pallini in colore), 1'aspartato 184 (quadrati in colore) e le regioni ricche di glicina (rettangoli in colore) della subunità catalitica della proteina chinasi dipendente dall’AM Pc. Le regioni tratteggiate in colore sono importanti per la regolazione. I siti di legame covalente con l' acido miristico, un acido grasso che contribuisce alI' ancoraggio della proteina chinasi alla membrana plasmatica, sono indicati da m. (Modificata da Taylor S et al: Annu Rev Cell Biol 8: ) In assenza di AMPc la protein chinasi dipendente dall’AMPc è costituita da 4 sub-unità: 2 regolatrici e 2 catalitiche. In presenza di livelli micromolari di AMPc ogni sub-unità R lega 2 AMPc, questo legame determina variazione conformazionale delle R tale da diminuire l’affinità per le sub-unità C. In figura è riportata l’ attivazione della proteina chinasi dipendente dall' AM Pc. Le due subunità regolatrici (subunità R) del complesso R2C2 sono legate da due ponti disolfuro. Il legame di due molecole di AMPc a ogni subunità R provoca la flessione di ogni subunità R nella regione cerniera e la liberazione delle due subunità catalitiche (C). (Elaborato da Taylor S: J Biol Chem 264:8443, 1989.) La famiglia delle proteine chinasi. Nonostante differenze tra le varie protein chinasi, tutte possiedono un nucleo catalitico comune (regione colorata) che contiene sia i domini dell' ATP e del legame del peptide sia il sito attivo nel quale si verifica il trasferimento del fosforo. I residui conservati sono stati allineati sulla lisina 72 (pallini in colore), l'aspartato 184 (quadrati in colore) e le regioni ricche di glicina (rettangoli in colore) della subunità catalitica della proteina chinasi dipendente dall’AM Pc. Le regioni tratteggiate in colore sono importanti per la regolazione. I siti di legame covalente con l' acido miristico, un acido grasso che contribuisce alI' ancoraggio della proteina chinasi alla membrana plasmatica, sono indicati da m. (Modificata da Taylor S et al: Annu Rev Cell Biol 8: ) Recentemente è stata determinata la struttura cristallografica della sub-unità catalitica della protein chinasi dipendente da AMPc; da tale studio si è evinto che il nucleo catalitico conservato è costituito da 2 lobi, 1 grande che contiene il sito di legame del peptide ed 1 piccolo che contiene il sito di legame all’ATP anomalo. Molte protein chinasi contengono una regione regolatrice definita domino del pseudosubstrato, la cui sequenza aacidica assomiglia a quella del sito di fosforilazione dei substrati proteici. Il dominio del pseudosubstrato si lega al sito attivo della protein chinasi ed impedisce la fosforilazione. L’attivazione delle protein chinasi può richiedere la fosforilazione o modificazione allosterica covalente (legame con AMPc per esempio) Molte protein chinasi contengono una regione regolatrice definita domino del pseudosubstrato, la cui sequenza amino-acidica assomiglia a quella del sito di fosforilazione dei substrati proteici.

Regolazione del metabolismo del glicogeno da parte dell’AMPc
Figura Il cAMP controlla la degradazione e la sintesi di glicogeno nel fegato e nelle cellule muscolari. (a) L'aumento del livello di cAMP determina un incremento nel livello di glucosio, attivando ladegradazione del glicogeno e inibendo la sintesi di glicogeno. La forma attiva della proteina chinasi cAMP-dipendente fosfori là la glicogeno sintetasi, riducendo la sua attività. La chinasi fosfori la anche la glicogeno fosforilasi chinasi, attivando la sua capacità di fosforilare e di attivare la glicogeno fosforilasi, I'enzima che degrada il glicogeno a glucosio 1-fosfato. La proteina chinasi cAMP-dipendente fosforila anche un inibitore della fosfoproteina fosfatasi, attivandolo. Di conseguenza, i gruppi fosforici aggiunti agli altri enzimi non vengono rimossi. (b) La diminuzione del livello di cAMP fa diminuire la concentrazione di glucosio 1-fosfato, inibendo la degradazione del glicogeno e attivando la sua sintesi. Questo risultato viene ottenuto tramite I'attiv~ionedella fosfoproteina fosfatasi; il gruppo fosforico viene rimosso dall'inibitore che, di conseguenza, viene inattivato. La fosfatasi attiva rimuove quindi i residui fosforici dalla glicogeno fosforilasi chinasi e dalla glicogeno fosforilasi, inibendo la degradazione del glicogeno. La rimozione del gruppo fosforico dalla glicogeno sintetasi, invece, attiva I'enzima e determina, di conseguenza, la sintesi di glicogeno. Maggiore quantità di glucosio disponibile Figura l'inibizione della fosfoproteina fosfatasi da parte del cAMP. la fosfoproteina fosfatasi è enzimaticamente attiva a meno che una proteina inibitrice non sia legata a essa. l'inibitore deve essere fosforilato dalla proteina chinasi cAMP-dipendente per potersi legate alla fosfoproteina fosfatasi e inibirla. In tal modo, la.fosfatasi è inattiva inpresenza di un atto livello di cAMPe attiva solo quando il livello di cAMP è basso. (Da P. Cohen, 1982, Nature, 296, p. 613.) Ad esempio, la protein chinasi A determina la fosforilazione e la conseguente attivazione di una glicogeno fosforilasi chinasi, che fosforila la glicogeno fosforilasi che a sua volta degrada il glicogeno in glucosio 1-fosfato. Il cAMP controlla la degradazione e la sintesi di glicogeno nel fegato e nelle cellule muscolari. (a) L'aumento del livello di cAMP determina un incremento nel livello di glucosio, attivando ladegradazione del glicogeno e inibendo la sintesi di glicogeno. La forma attiva della proteina chinasi cAMP-dipendente fosfori là la glicogeno sintetasi, riducendo la sua attività. La chinasi fosfori la anche la glicogeno fosforilasi chinasi, attivando la sua capacità di fosforilare e di attivare la glicogeno fosforilasi, I'enzima che degrada il glicogeno a glucosio 1-fosfato. La proteina chinasi cAMP-dipendente fosforila anche un inibitore della fosfoproteina fosfatasi, attivandolo. Di conseguenza, i gruppi fosforici aggiunti agli altri enzimi non vengono rimossi. (b) La diminuzione del livello di cAMP fa diminuire la concentrazione di glucosio 1-fosfato, inibendo la degradazione del glicogeno e attivando la sua sintesi. Questo risultato viene ottenuto tramite I'attiv~ionedella fosfoproteina fosfatasi; il gruppo fosforico viene rimosso dall'inibitore che, di conseguenza, viene inattivato. La fosfatasi attiva rimuove quindi i residui fosforici dalla glicogeno fosforilasi chinasi e dalla glicogeno fosforilasi, inibendo la degradazione del glicogeno. La rimozione del gruppo fosforico dalla glicogeno sintetasi, invece, attiva I'enzima e determina, di conseguenza, la sintesi di glicogeno. La proteina fosfatasi I é responsabile della defosforilazione di molte proteine fosforilate dalla proteina chinasi A, tra cui CREB; La sua attività é soppressa nelle cellule muscolari stimolate da adrenalina dalla proteina inibitrice della fosfatasi. Figura l'inibizione della fosfoproteina fosfatasi da parte del cAMP. la fosfoproteina fosfatasi è enzimaticamente attiva a meno che una proteina inibitrice non sia legata a essa. l'inibitore deve essere fosforilato dalla proteina chinasi cAMP-dipendente per potersi legate alla fosfoproteina fosfatasi e inibirla. In tal modo, la.fosfatasi è inattiva inpresenza di un atto livello di cAMPe attiva solo quando il livello di cAMP è basso. (Da P. Cohen, 1982, Nature, 296, p. 613.) Minore quantità di glucosio disponibile

Amplificazione del segnale
Una delle funzioni della cascata di chinasi è l’amplificazione La cascata ha diversi vantaggi: 1) essa consente di regolare un intero gruppo di reazioni catalizzate enzimaticamente sulla base del livello di un’unica specie, l’AMPc; essa consente inoltre di invertire rapidamente gli effetti quando il livello di cAMP cala. Inoltre la cascata di eventi consente una notevole amplificazione del segnale inizialmente debole. Ad esempio la concentrazione ematica di epinefrina può essere estremamente bassa M e tale stimolo genera in cellula una concentrazione di cAMP superiore a 10-6 M. 10-4 M 10-2 M

Sistema del fosfatidilinositolo, Ca2+ e 1,2 diacilglicerolo
L’idrolisi dei fosfatidil-inositolo è legato a diverse vie di segnalazione: 1) Aumenta la concentrazione di calcio intracellulare (tramite l’IP3); 2) Attiva la sintesi degli eicosenoidi (tramite l’acido arachidonico) 3) Attiva la protein chinasi C (tramite il diacil-glicerolo e il calcio) Meccanismo d’azione dell’IP3 Molti ormoni si legano a recettori di superficie e determinano l’innalzamento del calcio citosolico tramite la fuoriuscita dagli store intracellulari (reticolo endoplasmatico o altre vescicole). Agli inizi degli anni 80 quando si dimostrò che l’aumento del calcio citosolico è preceduto dall’idrolisi di un fosfolipide di membrana, il fosfatidilinositolo 4,5-difosfato in risposta ai segnali cellulari. Questo fosfolipide appartiene ad una famiglia di inositolo fosfolipidi, con inositolo fosforilato (con 1 o 2 fosfati). Sebbene tutti e tre gli inositolo fosfolipidi possono essere degradati in risposta al segnale, la demolizione critica è quella del PIP2, anche se è il meno abbondante costituendo il 10% di tutti gli inositolo fosfolipidi e meno dell’1% di tutti i fosfolipidi. L’idrolisi di questo fosfolipide operata dalla fosfolipasi C porta a 2 prodotti: 1,2 diacil-glicerolo che resta nella membrana e l’inositolo 1,4,5 trifosfato (IP3) idrosolubile. Una proteina G accoppia i recettori ormonali con la fosfolipasi C; il trattamento con la tossina della pertosse inattiva G e abolisce l’attivazione della fosfolipasi C. L’IP3 diffonde nel citosol, si lega a suoi recettori sul reticolo endoplasmico e promuove il rilascio del calcio. Il diacil-glicerolo rimane nella membrana e aiuta ad attivare la protein chinasi C. Vi sono tre classi di fosfolipasi C (, , ) la classe beta viene attivata da recettori legati a proteine G. La classe gamma viene invece attivata da una seconda classe di recettori tirosin chinasici che attivano la via di segnalazione dell’inositolo fosfolipide senza una proteina G intermediaria. Dopo un secondo dall sua formazione l’IP3 viene idrolizzato a inositolo 1,4-difosfato, molecola che non determina rilascio di altri ioni calcio. In pochi minuti gli store vengono esauriti ed il mantenimento di elevati livelli di calcio citosolico richiede l’ingresso dall’ambiente extracellulare. Nelle cellule pancreatico tale ingresso è mediato dall’inositolo 1,3,4,5 tetrafosfato (IP4) derivante dalla fosforilazione di IP3 IP3 si lega attivandoli ai recettori-canale sul RE, provocando l’uscita di calcio; una volta rilasciato il calcio può mediare fuoriuscita di altro calcio

Il calcio come messaggero intracellulare
Sistema di controllo del calcio citosolico Vie di entrata del Ca2+ in risposta a segnali Alcuni esempi Tessuto Ormone che induce aumento di IP3 e di Ca2+ Risposta cellulare Cellule acinose del pancreas Acetilcolina Secrezione enzimi digestivi Ghiandola salivare (parotide) Secrezione di amilasi Cellule  del pancreas Aceticolina Secrezione di insulina Muscolatura liscia dei vasi e dello stomaco Contrazione Fegato Vasopressina Conversione glicogeno in glucosio Piastrine del sangue Trombina Aggregazione, cambiamenti di forma, secrezione di ormoni Mastociti Antigene Secrezione di istamina Fibroblasti Fattori di crescita peptidici, bombesina e PDGF Sintesi di DNA, divisione cellulare Uova di riccio di mare Spermatozoi Formazione membrana di fecondazione La concentrazione di calcio liberi nel citosol è mantenuta al di sotto degli 0.2 M. Le PMCA ed il controtrasporto Na-Ca (Ca-ATPasi del plasmalemma) pompano fuori il calcio dalla cellula. Le serca pompano il calcio nel reticolo endoplasmico o in altre vescicole, nei mitocondri; proteine legano il calcio. Le vie di entrata del calcio in cellula in risposta a segnali cellulari sono i canali specifici o tramite l’inositolo trifosfato il cui legami a recettori specifici del reticolo endoplasmico determina l’apertura di altri canali per il calcio. Un aumento anche modesto del calcio dell’ordine anche di 1 micromole scatena risposte cellulari. Ad esempio nelle cellule secernenti come quelle beta del pancreas, un aumento modesto della concentrazione degli ioni calcio citosolici induce esocitosi delle vescicole di secrezione e liberazione di insulina. Nelle cellule muscolari ed epatiche un aumento di calcio determina in quelle muscolari un la contrazione ed in entrambi i tipi cellulari la degradazione del glicogeno a glucosio-1-fosfato. Ad esempio nelle uova di riccio di mare un segnale prodotto dagli spermatozoi determina entrata di calcio e formazione della membrana di fecondazione.

Le variazioni di calcio intracellulare si possono visualizzare
Figura Variazioni nella concentrazione locale di ioni Ca2+ in un uovo di riccio di mare dopo la fecondazione. Il Ca2+ cellulare è stato monitorato per mezzo della fluorescenza del fura-2, attraverso un microscopio (Figura 19.27); a fini grafici, le concentrazioni di Ca2+ sono espresse secondo una scala graduata di colori (a destra) in micromoli di Ca2+. La concentrazione di Ca2+ aumenta inizialmente nel punto in cui lo spermatozoo è entrato (la parte in basso a sinistra della cellula) e si innalza, diffondendosi come un'onda. In un tempo successivo, la concentrazione di Ca2+ diventa elevata e uniforme in tutta la cellula, poi decade uniformemente allo stato di riposo. (Da R.Y. Tsien e M. Poenie, 1986, TIBS, 11, pp ; per gentile concessione di j. Alderton, M.Poenie, R.A. Steinhardt e R.Y. TsienJ Figura La concentrazione citosolica di Ca2+ può esser monitorata in continuo sfruttando la fluorescenza dei complessi Ca2+-fura-2. Aggiunto al mezzo di coltura, l'estere lipofilo del fura-2 (a sinistra) diffonde attraverso la membrana plasmatica e viene idrolizzato a fura-2 dalle esterasi del citosol. Il fura-2, di carattere non lipofilo (a destra) non può attraversare le membrane cellulari e resta nel citosol. In assenza di Ca2+ , il fura-2 non è fluorescente e la fluorescenza dei complessi Ca2+-fura-2 è proporzionale alla concentrazione di ioni Ca2+ del citosol. La concentrazione citosolica di Ca2+ può esser monitorata in continuo sfruttando la fluorescenza dei complessi Ca2+-fura-2. Aggiunto al mezzo di coltura, l'estere lipofilo del fura-2 (a sinistra) diffonde attraverso la membrana plasmatica e viene idrolizzato a fura-2 dalle esterasi del citosol. Il fura-2, di carattere non lipofilo (a destra) non può attraversare le membrane cellulari e resta nel citosol. In assenza di Ca2+ , il fura-2 non è fluorescente e la fluorescenza dei complessi Ca2+-fura-2 è proporzionale alla concentrazione di ioni Ca2+ del citosol. Variazioni nella concentrazione locale di ioni Ca2+ in un uovo di riccio di mare dopo la fecondazione. Il Ca2+ cellulare è stato monitorato per mezzo della fluorescenza del fura-2, attraverso un microscopio ; a fini grafici, le concentrazioni di Ca2+ sono espresse secondo una scala graduata di colori (a destra) in micromoli di Ca2+. La concentrazione di Ca2+ aumenta inizialmente nel punto in cui lo spermatozoo è entrato (la parte in basso a sinistra della cellula) e si innalza, diffondendosi come un'onda. In un tempo successivo, la concentrazione di Ca2+ diventa elevata e uniforme in tutta la cellula, poi decade uniformemente allo stato di riposo. (Da R.Y. Tsien e M. Poenie, 1986, TIBS, 11, pp ; per gentile concessione di j. Alderton, M.Poenie, R.A. Steinhardt e R.Y. Tsien) Nelle cellule di grandi dimensioni si possono distinguere differenze nella concentrazione di calcio in regioni specifiche del citosol

Complesso calcio-calmodulina
Figura 9.17 La calmodulina, proteina citosolica di 149 aacidi con quattro siti di legame per il calcio, forna il complesso Ca2+ /calmodulina, un importante regolatore intracellulare. (A) Sequenza amrninoacidica del sito di legame per il calcio situato all'estremità C-terrninale della calmodulina. Ogni sito di legame contiene residui di aspartato, glutammato ed asparagina (mostrati in colore) le cui catene laterali stabiliscono legami ionici con uno ione Ca2+, formando un'ansa nello scheletro della proteina. Gli altri siti di legame contengono anche residui di treonina e di serina, e gli atomi di ossigeno presenti nelle catene laterali di questi amminoacidi si associano allo ione calcio. (B) Modello di una molecola di calmodulina a cui sono legati quattro ioni calcio (sfere grigie). (C) Rappresentazione schematica della variazione conformazionale indotta dal legame del calcio alla calmodulina. Quando tutti e quattro i siti di legame per il calcio sono occupati, la calmodulina subisce un cambiamento della struttura terziaria. Il risultante complesso Ca2+/calmodulina può legarsi a numerose proteine bersaglio, regolandone l'attività. [Parte B cortesemente concessa da Y.S. Babu e W.J. Cook; parti A e C adattate da Lodish et al., 1995.] La calmodulina, proteina citosolica di 149 aacidi con quattro siti di legame per il calcio, forna il complesso Ca2+ /calmodulina, un importante regolatore intracellulare. (A) Sequenza amrninoacidica del sito di legame per il calcio situato all'estremità C-terrninale della calmodulina. Ogni sito di legame contiene residui di aspartato, glutammato ed asparagina (mostrati in colore) le cui catene laterali stabiliscono legami ionici con uno ione Ca2+, formando un'ansa nello scheletro della proteina. Gli altri siti di legame contengono anche residui di treonina e di serina, e gli atomi di ossigeno presenti nelle catene laterali di questi amminoacidi si associano allo ione calcio. (B) Modello di una molecola di calmodulina a cui sono legati quattro ioni calcio (sfere grigie). (C) Rappresentazione schematica della variazione conformazionale indotta dal legame del calcio alla calmodulina. Quando tutti e quattro i siti di legame per il calcio sono occupati, la calmodulina subisce un cambiamento della struttura terziaria. Il risultante complesso Ca2+/calmodulina può legarsi a numerose proteine bersaglio, regolandone l'attività. [Parte B cortesemente concessa da Y.S. Babu e W.J. Cook] La calmodulina è strettamente correlata alla troponina delle cellule muscolari scheletriche; fra i bersagli regolati dal complesso Ca2+-calmodulina vi sono vari enzimi e proteine di trasporto come la Ca2+-ATPasi che espelle calcio dalla cellula; 2) la > parte degli effetti é però mediata da protein-chinasi dipendenti dal complesso calcio-calmodulina; La calmodulina è strettamente correlata correlata alla troponina delle cellule muscolari scheletriche; fra i bersagli regolati dal complesso Ca2+-calmodulina vi sono enzimi e proteine di trasporto come la Ca2+-ATPasi; 2) la > parte degli effetti é mediata da protein-chinasi dipendenti dal complesso calcio-calmodulina;

CaM chinasi multifunzionali
Regolazione operata dal complesso Ca2+-calmodulina Chinasi calmodulina dipendente III (CaMKIII) Del fattore eucariotico di allungamento II Chinasi che fosforila catena leggera della miosina (MLCK) Fosforilasi chinasi (FosCh) CaM chinasi specifiche Adenilato-ciclasi Ca2+-ATPAsi Guanilato ciclasi Fosfolipasi Fosfodiesterasi Le prime chinasi CaM scoperte sono quelle della catena leggera della miosina (muscolatura liscia) e la fosforilasi chinasi che attiva demolizione del glicogeno. Alcune protein chinasi calcio-calmodulina come, la chinasi della catena leggera della miosina e la fosforilasi chinasi agiscono su di un solo substrato proteico mentre altre chinasi sono moltifunzionali. Nel muscolo liscio l’aumento di calcio citosolico stimola l’attività della chinasi della catena leggera di miosina, la conseguente fosforilazione delle catene leggere regolatrici permette di effettuare la contrazione. La protein chinasi calcio-calmodulina dipendente di tipo II, tra le più abbondanti proteine del sistema nervoso centrale (sino al 2%) delle proteine totali, riveste un ruolo essenziale nei meccanismi attrraverso cui l’aumento di calcio nel terminale nervoso produce la liberazione di neurotrasmettitore per esocitosi. Il suo principale substrato è la sinapsina I che si lega alle vescicole sinaptiche impedendo loro di partecipare all’esocitosi sino a chè la fosforilazione ne determina il distacco dalle vescicole e la conseguente esocitosi. Nelle cellule muscolari, la stimolazione nervosa porta alla liberazione di ioni calcio dal reticolo sarcoplasmatico, che determina contrazione e tramite il complesso calcio-calmodulina la degradazione di glicogeno in glucosio 1-fosfato, fornendo il carburante necessario alla contrazione muscolare. Vi è un interazione tra il segnale inviato tramite calcio-calmodulina e la protein chinasi A (AMP ciclico dipendente) mediata dalla glicogeno fosforilasi chinasi CaM chinasi multifunzionali Ia, Ib, II e IV La CaM II fosforila Sinapsina I nel tessuto nervoso Fosforilazione proteine nucleari e Della membrana Fosforilazione proteine del citoscheletro ( Disassemblaggio dei Microtubuli)

Attivazione della chinasi CaM II
La chinasi CaM II é un esempio di chinasi CaM multifunzionale. La chinasi CaM II é un esempio di chinasi CaM multifunzionale. Nel tessuto nervoso, dove è abbondante attivando la tirosina idrossilasi favorisce la risintesi delle catecolammine; l'ingresso di calcio attraverso i canali voltaggio-dipendenti, promuove sia la liberazione di neurotrasmettitore che la risintesi tramite la chinasi CaM II L'attivazione della chinasi CaM II può servire da traccia di memoria di un precedente impulso di Ca2+ a causa della proprietà di autofosforilazione. L’enzima è un complesso proteico di 12 sub-unità (, , , )2 espresse in proporzioni diverse in tipi cellulari diversi. La sub-unità alfa espressa solo nel cervello è rappresentata in figura. Il legame calcio-camodulina altera la conformazione, inverte l’interazione domino inibitore – catalitico, consentendo al dominio catalitico di fosforilare il dominio inibitore delle altre sub-unità del congresso, oltre ad altre proteine della cellula. L’autofosforilazione del complesso enzimatico (per fosforilazione reciproca delle sue sub-unità) prolunga l’attività dell’enzima in 2 modi: 1) intrappola la calcio/calmodulina legata in modo che questa non si dissoci dal complesso enzimatico finchè il calcio ritorna a livelli basali per almeno 10 secondi; 2) converte l’enzima ad una forma indipendente da calcio così che la chinasi rimane attiva anche dopo che la calcio-calmodulina si è dissociata. L’attività continua fino a che il processo di autofosforilazione non viene sopraffatto da una proteina fosfatasi. Fosforila la sinapsina I attivando l’esocitosi dei neurotrasmettitori Attiva la tirosina idrossilasi e di conseguenza la sintesi di catecolammine L'attivazione della chinasi CaM II può servire da traccia di memoria di un precedente impulso di Ca2+ a causa della proprietà di autofosforilazione

La via dell'AMP ciclico e del Ca2+ interagiscono
Un esempio classico é la fosforilasi chinasi del muscolo scheletrico che può essere attivata sia dal complesso calcio-calmodulina che dalla protein chinasi A A) Il calcio attiva la contrazione muscolare, libera le risorse enegetiche necessarie (glucosio da glicogeno) sia: attivando la fosforilasi chinasi 2)inibendo la glicogeno sintasi (mediante fosforilazione da parte della chinasi CaM); B) L’AMPc, indotto da adrenalina, attiva la PKA che fosforila la fosforilasi chinasi Ciò prepara la cellula muscolare ad una accresciuta domanda di energia, sensibilizzando la fosforilasi chinasi a basse concentrazioni di calcio. PKA Ca2+ Un esempio classico é la fosforilasi chinasi del muscolo scheletrico che può essere attivata sia dal complesso calcio-calmodulina che dalla protein chinasi A ( e quindi dall'AMPc) Il calcio attiva sia la contrazione muscolare e libera le risorse enegetiche necessarie (glucosio da glicogeno) sia: 1) attivando la fosforilasi chinasi 2) inibendo la glicogeno sintasi (mediante fosforilazione da parte della chinasi CaM); B) fosforilazione della fosforilasi chinasi ad opera della protein chinasi A, attivata da AMPc a sua volta indotto da adrenalina, preparano la cellula muscolare ad una accresciuta domanda di energia, sensibilizzando la fosforilasi chinasi a basse concentrazioni di calcio. La fosforilasi chinasi di muscolo di mammifero è costituita da 4 sub-unità. La sub-unità  ha attività catalitica dell’enzima attivo; le sub-unità  e  quella  (cioè la calmodulina) mediano la regolazione dell’enzima da parte rispettivamente dell’AMPc e del calcio. Il complesso enzimatico effettico contiene quattro copie di ciascuna sub-unità.

Ruolo del diacilglicerolo
Dà origine ad acido arachidonico, che agisce a sua volta come messaggero essendo usato nella sintesi degli eicosanoidi; Attiva la protein chinasi C Il diacilglicerolo derivato dall’idrolisi del fosfatidil-inositolo può dare origine all’acido arachidonico usato come precursore degli eicosenoidi oppure attivare la protein chinasi C. Esitono 4 classi di eicosanoidi: prostaglandine, prostacicline, tromboxani e leucotrieni, tutti sono prodotti in prevalenza dall’acido arachidonico. Tranne i leucotrieni tutti gli altri sono dipendenti dalla cicloossigenasi; la sintesi di leucotrieni richiede la presenza dell’enzima lipoossigenasi. Gli eicosanoidi hanno un ruolo importante nelo dolore, nella febbre e nell’infiammazione. Ormoni come il cortisone inibiscono l’attività della fosfolipasi nel primo passaggio della via di sintesi degli eicosenoidi e sono usati largamente per curare malattie infiammatorie non infettive. Sostanze non steroidee come aspirina e ibuprofene bloccano il primo passaggio di ossidazione catalizzato dalle cicloossigenasi Questa chinasi allo stato inattivo è solubile nel citosol; il legame con il calcio ne causa il legame con la faccia citoplasmatica della membrana dove può essere attivata dal diacil-glicerolo. Quindi, calcio e diacilglicerolo, originati dalla via di segnalazione del fosfatidil-inositolo, interagiscono tra loro. L’attivazione delle protein chinasi C in cellule diverse determina un’ampia gamma di risposte cellulari. Nel fegato uno dei bersagli della PKC è la glicogeno sintetasi, inattivata dalla fosforilazione mediata da PKC. L’attivazione di PKC quindi da una parte inibisce la sintesi di glicogeno (inibendo la glicogeno sintetasi); l’aumento del calcio citosolico derivato dalla presenza di IP3 stimola l’attivazione della glicogeno fosforilasi. Ciò dimostra che molteplici secondi messaggeri si coordinino per ottenere un’unica risposta cellulare. Alcune sostanze dette promotori tumorali,come gli esteri del forbolo, attivano notevolmente e specificamente la proteina chinasi C e ciò fa ritenere che l’attivazione della PKC sia un evento chiave nella proliferazione cellulare. Tra i substrati della protein chinasi C vi sono i recettori di superficie di molti ormoni della crescita, come fattore di crescita dell’epidermide (EGF). La fosforilazione del recettore per EGF da parte della PKC ne determina una diminuzione di affinità per EGF e quindi un’inibizione dello stimolo di crescita. La produzione eccessiva di PKC in fibroblasti normali fa sì che le cellule non necessitano di crescere aderenti alla matrice extracellulare. La PKC può attivare trascrizione di geni specifici tramite due vie: 1) cascata di fosforilazioni che porta alla fosforilazione della Map-chinasi che a sua volta fosforila la proteine regolatrice dei geni Elk-1. Elk-1 è legato alla sequenza del DNA (elemento di risposta al siero, SRE) in associazione ad un’altra proteina che lega il DNA (fattore di risposta al siero. SRF). 2) fosforilazione di Ik-B che rilascia la proteina regolatrice dei geni NF-kB che può migrare nel nucleo e attivare la trascrizione di geni specifici. la protein chinasi C (PKC) dipende dal calcio; quando attivata da diacilglicerolo fosforila residui di serina e treonina; la concentrazione piu alte di protein chinasi C si trova nel cervello, dove fosforila canali ionici alterando l'eccitabilità della membrana plasmatica; può attivare trascrizione genica secondo due vie

Segnalazione tramite recettori di superficie collegati ad enzimi.
1) Recettori guanilico ciclasi (produzione di GMPc); 2) recettori tirosina-chinasici; 3) recettori associati a tirosina-chinasi; 4) recettori tirosina fosfatasi; 5) recettori serina/treonina chinasi; Recettori guanilico ciclasi Utilizzati dai peptidi natriuretici atriali, i quali determinano stimolazione del rene ad eliminare acqua e sali e rilassamento dei vasi sanguigni. I recettori guanilico ciclasi mediano il loro effetto, producendo direttamente GMPc che si lega ad una protein chinasi G, attivandola, che fosforila proteine specifiche a livello dei residui di serina e treonina. Recettori guanilico ciclasi Utilizzati dai peptidi natriuretici atriali, i quali determinano stimolazione del rene ad eliminare acqua e sali e rilassamento dei vasi sanguigni. I recettori guanilico ciclasi mediano il loro effetto, producendo direttamente GMPc che si lega ad una protein chinasi G, attivandola, che fosforila proteine specifiche a livello dei residui di serina e treonina.

Recettori tirosina-chinasici
Il legame di un ormone induce dimerizzazione e autofosforilazione dei recettori che in tal modo si attivano EGF = Epidermal growth factor IGF-1 = insulin-like growth factor NGF = nerve growth factor PDGF = piastrine derived growth factor M-CSF = factor stimulating Colonie - macrophages FGF = fibroblast i growth factor VEGF = vasculare endothelium growth factor Vi sono al momento 8 sottofamiglie di recettori tirosina chinasici. Il domino tirosina chinasi è in alcune famiglie interrotto da una regione inserita della chinasi. Le prime 2 sottoclassi (I e II) possiedono domini extracellulari con sequenze ripetute ricche di cisteina, mentre I domini extracellulari delle altre sottoclassi hanno regioni simili alle immunoglobuline (anelli). La regione intracellulare, l’inserto chinasico a lunghezza variabile, sono I siti di regolazione. Il legame di una proteina induce dimerizzazione e autofosforilazione dei recettori che in tal modo si attivano. I recettori per l'insulina sono già in forma tetramerica e di conseguenza il legame dell'ormone al suo sito provoca interazione allosterica fra le due metà del recettore che induce l'autofosfilazione del recettore, che si attiva e i suoi domini catalitici fosforilano una proteina chiamata IRS-1 (substrato 1 del recettore dell'insulina). Le protein chinasi specifiche per la tirosina svolgono un ruolo fondamentale nella trasformazione cellulare. Le proteine G monomeriche di tipo RAS sono coinvolte nella mediazione degli effetti che ligandi mitogeni inducono sulla proliferazione cellulare. L’attivazione delle RAS si traduce nella trascrizione di alcuni geni cruciali nei processi di crescita cellulare. Ad esempio è coinvolta la cascata delle map chinasi. Esistono interazioni tra la via della PKC e le vie tirosin-chinasiche, l’isoforma gamma della fosfolipasi C è attivata da proteine di tipo RAS I recettori per l'insulina sono già in forma tetramerica e di conseguenza il legame dell'ormone al suo sito provoca interazione allosterica fra le due metà del recettore che induce l'autofosfilazione del recettore, che si attiva e i suoi domini catalitici fosforilano una proteina chiamata IRS-1 (substrato 1 del recettore dell'insulina)

I residui di tirosina fosforilata sono riconosciuti da proteine con domini SH2
proteina che attiva la GTPasi (GAP); 2) fosfolipasi C-gamma (PLC-gamma); 3) fosfatidilinositolo 3‘ chinasi (PI3-chinasi) Il recettore tirosin chinasico per la PDGF contiene 5 siti di autofosforilazione in tirosina, 3 nell’inserto della chinasi e 2 nella coda carbossiterminale a cui si legano le 3 proteine segnale mostrate a sinistra. Vi è un sito di legame per la fosfolipasi C che determina l’attivazione di tale enzima e la stimolazione della via di trasduzione degli inositoli fosfolipidi. Nelle tre proteine segnale sono presenti dei domini SH2 (rosso) e SH3 (blu), la sui struttura tridimensionale è stata determinata tramite cristallografia a raggi X. Il domino SH2 è un modulo compatto che può essere inserito in qualsiasi proteina. Ed ha la funzione di riconoscere specificamente le fosfotirosine; vi è anche un sito di legame di una catena laterale di un aminoacido specifico (es. isoleucina) che può determinare la specificità del legame della proteina al recettore fosforilato.

Le proteine Ras forniscono il collegamento nelle cascate di reazioni intracellulari attivate dai recettori tirosina-chinasi. Le proteine Ras sono GTPasi monomeriche e possono essere regolata da GTPasi (GAP) che tende a inibirle o da proteine rilascianti GDP le GNRP he tendono ad attivare Ras. Le proteine Ras sono GTPasi monomeriche e possono essere regolata da proteine che attivano la GTPAsi (GAP) che tende a inibirle o da proteine rilascianti GDP le GNRP he tendono ad attivare Ras. Le proteine che attivano la GTPasi (GAP) inattivano Ras stimolandolo a idrolizzare il GTP legato. Quelle che rilasciano GDP (GNRP) attivano Ras stimolandolo a rilasciare il GDP; dato che la concentrazione di GTP nel citosol è 10 volte > di quella del GDP, Ras tenderà a legare GTP una volta che si è liberato del GTP. Due GAP che regolano Ras (Ras GAP) sono state caratterizzate nelle cellule dei mammiferi e sono la p120GAP e la neurofibromina (codificata da un gene che subisce una mutazione nella malattia genetica umana neurofibromatosi) Entrambe sono ubiquitarie anche se l’una o l’altra sembrano predominare a seconda del tipo di cellula, nel mantenere la > parte delle proteine Ras ( 95%) in uno stato inattivo con GDP legato.

Ras attiva una cascata di fosforilazioni in serina/treonina che attiva la MAP-chinasi
Le MAP-chinasi attivate possono migrare nel nucleo e fosforilare ElK-1 attivandolo alla trascrizione del gene fos ; MAP può fosforilare la proteina Jun che si combina con la proteina fos a formare la proteina regolatrice AP-1 che può attivare numerosi altri geni; anche la chinasi C può fosforilare Jun o attivare MAP chinasi chinasi chinasi. Nella via attivata da recettori tirosin chinasici tramite Ras, la MAP-chinasi chinasi chinasi è spesso una serina/treonina chiamata Raf , che si pensa essere attivata dal legame di Ras attivato. Nella via attivata da recettori legati a proteine G tramite la chinasi C, la MAP-chinasi chinasi può essere sia Raf che una serina/treonina chinasi diversa. Una cascata simile di fosforilazioni serina/treonina che coinvolge proteine correlate strutturalmente e funzionalmente opera in modo da integrare e amplificare i segnali provenienti da diversi stimoli extracellulari. I recettori tirosin chinasici possono anche attivare una via di segnalazione al nucleo più diretta, fosforilando, e quindi attivando, proteine regolatrici dei geni che contengono domini SH2. Le MAP-chinasi attivate possono migrare nel nucleo e fosforilare ElK-1 attivandolo alla trascrizione del gene fos ; MAP può fosforilare la proteina Jun che si combina con la proteina fos a formare la proteina regolatrice AP-1 che può attivare numerosi altri geni; anche la chinasi C può fosforilare Jun o attivare MAP chinasi chinasi chinasi

Recettori associati a tirosina chinasi
Comprendono recettori per l'ormone della crescita e prolattina; funzionano tramite tirosina chinasi associate che fosforilano varie proteine bersaglio quando il recettore lega il suo ligando Le chinasi coinvolte con questi recettori sono: SRC e JANUS. Figura 5-14 I recettori per l'ormone della crescita (GH), la prolattina e alcuni altri ligandi non possiedono attività tirosina chinasica intrinseca. Il recettore per l'ormone della crescita si dimerizza in seguito al legame di GH, lega una o più tirosina chinasi di tipo JAK che fosforila se stessa e il recettore. Le tirosina chinasi di tipo STAT si legano al complesso e vengono quindi fosforilate. La forma fosforilata di STAT si dissocia sotto forma di dirneri, che vengono successivamente trasportati al nucleo, dove determinano la fosforilazione di fondamentali fattori di trascrizione. JAK, chinasi specifiche per la tirosina di tipo Janus; STAT, trasduttori del segnale e attivatori della trascrizione. I recettori associati a tirosin chinasi comprendono recettori per l'ormone della crescita e prolattina; funzionano tramite tirosina chinasi associate che fosforilano varie proteine bersaglio quando il recettore lega il suo ligando Le chinasi coinvolte con questi recettori sono: SRC e JANUS. Nel caso dell’ ormone della crescita inaspettatamente il ligando monomerico è in grado di legare insieme I suoi recettori, ciò richiede che due recettori identici siano in grado di distinguere parti diverse dell’ormone. La dimerizzazione indotta dal ligando porta insieme I domini citoplasmatici dei due recettori transmembrana a singolo passaggio. Ciò a sua volta attiva le tirosin chinasi non recettoriali (SRC e JANUS). Oltre ai recettori per l'ormone della crescita (GH anche i recettori per la prolattina e alcuni altri ligandi non possiedono attività tirosina chinasica intrinseca. Il recettore per l'ormone della crescita si dimerizza in seguito al legame di GH, lega una o più tirosina chinasi di tipo JAK che fosforila se stessa e il recettore. Le tirosina chinasi di tipo STAT si legano al complesso e vengono quindi fosforilate. La forma fosforilata di STAT si dissocia sotto forma di dirneri, che vengono successivamente trasportati al nucleo, dove determinano la fosforilazione di fondamentali fattori di trascrizione. JAK, chinasi specifiche per la tirosina di tipo Janus; STAT, trasduttori del segnale e attivatori della trascrizione.

Protein chinasi

Risposta ai segnali extracellulari
• Alcune risposte cellulari sono graduate in maniera semplicemente proporzionale alla concentrazione del ligando (risposta primaria ad ormoni steroidei); • In altri casi la risposta cellulare é piu complessa, man mano che aumenta il numero di molecole effettrici che deve legarsi simultaneamente per attivare un molecola bersaglio.

Adattamento della cellula bersaglio
Quando la cellula bersaglio é sottoposta ad uno stimolo per un periodo prolungato, la sua capacità di risposta diminuisce (processo di adattamento e sensibilizzazione). Adattamento lento Gli ormoni proteici una volta legati ai loro recettori vengono internalizzati con i loro recettori mediante un meccanismo di endocitosi e poi sottoposti a degradazione lisosomiale, mentre i recettori riciclano; a volte anche i recettori sono degradati e questo comporta una diminuzione nel tempo se essi sono sottoposti a continua esposizione del ligando (down regulation) Adattamento rapido comporta fosforilazione del recettore Trasporto degli ormoni e loro eliminazione (mg/min) rimossi ml depurati VCM = = = clearance metabolica mg/ml di plasma minuti

Alcune proteine G regolano direttamente canali ionici
Recettori muscarinici dell'acetilcolina mediante attivazione di proteine Gi (inibitrici) che possono: 1) inibire l'adenilato ciclasi; 2) promuovere direttamente l'apertura dei canali del K+ sulla membrana delle cellule muscolari cardiache, rendendo piu difficile la depolarizzazione della cellula e contribuendo all'effetto inibitorio dell'acetilcolina sul cuore; Alcuni recettori fanno diminuire l'AMPc inibendo l'adenilato ciclasi tramite una proteina G trimerica inibitrice

I segnali cellula-cellula: ormoni e recettori

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