FASE SPERIMENTALE 1 Rendere le cellule di Escherichia coli

Presentazione sul tema: "FASE SPERIMENTALE 1 Rendere le cellule di Escherichia coli"— Transcript della presentazione:

1 FASE SPERIMENTALE 1 Rendere le cellule di Escherichia coli
OBIETTIVO : LA COMPETENZA Rendere le cellule di Escherichia coli competenti, cioè in grado di far entrare geni estranei attraverso DNA plasmidico Classe 5^ BIO2 Primo Levi

2 Una cellula è chiamata competente se è in grado di assumere del DNA esogenota e integrarlo nel suo genoma. COMPETENZA NATURALE La competenza è determinata geneticamente: -proteina legante DNA -proteina di competenza -proteina RecA COMPETENZA ARTIFICIALE I batteri non hanno i geni per la competenza e questa viene indotta in laboratorio con tecniche specifiche.

3 LA COMPETENZA In laboratorio
Si vuole aumentare la permeabilità della membrana cellulare Raffreddare le cellule dell’inoculo standardizzato per 10 minuti in ghiaccio tritato Trasferire 2 ml in provetta e centrifugare a rpm per 2 min Scartare il surnatante e risospendere in CaCl2 e MgCl2 freddo Centrifugare a rpm per 2 minuti a 4° C Risospendere in CaCl2 freddo Mantenere in ghiaccio Come???

4 Confronto allo spettrofotometro:
Inoculo standardizzato Concentrazione nota Confronto allo spettrofotometro: Standard Turbidimetrico Inoculo Mc Farland max 108 cell/ml ?

5 Come si ottiene Inoculo standardizzato
Inoculare una colonia singola in 20mL di LB broth incubare in agitazione o/n a 37°C Trasferire un’aliquota della brodocoltura o/n in LB broth sterile in beuta, effettuando una diluizione 1:100 (es. 250 mL di inoculo in 25 mL di brodo fresco) e controllare l’assorbanza a λ=595nm. Il valore non dovrebbe essere superiore a 0.05 O.D. Far crescere in agitazione a 37°C da 3 a 4 ore circa. Controllare l’assorbanza a λ=595nm, avendo presente che le cellule vanno raccolte quando la brodocoltura ha raggiunto un’assorbanza a λ=595nm, pari a 0.4 O.D., che corrisponde a circa 108 cell/ml. Se l’assorbanza va bene raffreddare le cellule, incubandole per 10 min in ghiaccio tritato. 5

6 Il protagonista: Escherichia coli
È un Enterobattere coliforme: “Enterico" perché è un componente della flora intestinale; “Coliforme” perché vive nel colon. E’ di forma bastoncellare e aerobio facoltativo; “Gram negativo” in base alla composizione della parete cellulare; E’ oggetto di molti studi e per questo si è a conoscenza dell’intera mappatura genomica (4500 geni)

7 Ed ora… Passiamo il testimone