Anatomia Patologica Dr. Maurizio Maisano

Anatomia Patologica Dr. Maurizio Maisano
Servizio di Anatomia Patologica Azienda Ospedaliera “Bianchi-Melacrino-Morelli” Reggio Calabria

Anatomia Patologica Che cos’è ?
E’ una branca della medicina che studia le modificazioni morfologiche che una malattia produce su organi e tessuti. Se le alterazioni morfologiche sono tipiche della malattia (“patognomoniche”) il loro riscontro comporta la diagnosi della malattia in sé (a differenza di altre discipline di laboratorio).

Anatomia Patologica Lo scopo finale della diagnosi AP è fornire un giudizio il più preciso possibile su La natura della malattia Lo stadio di sviluppo e le prospettive evolutive Indicazioni utili ai fini della terapia

Anatomia Patologica Caratterizzazione morfologica delle lesioni:
Istologia: studio dei tessuti Citologia: studio delle cellule Patologia oncologica Patologia non oncologica (es. infiammatoria, degenerativa etc.)

Stretta correlazione con la clinica:
Anatomia Patologica Stretta correlazione con la clinica: i dati clinici sono un fondamentale supporto per la diagnosi isto e citopatologica. In assenza di dati clinici o in presenza di dati clinici non corretti o non adeguatamente raccolti, esiste un concreto rischio di diagnosi errata o incompleta

Risposta del patologo alle richieste del clinico (1)
Risposta diagnostica Diagnosi di certezza: il campione inviato contiene tutte le informazioni di una precisa malattia; Diagnosi di compatibilità: il campione contiene alcune informazioni (non tutte) caratteristiche della malattia sospettata. Viene formulato un giudizio di compatibilità con il sospetto clinico.

Risposta del patologo alle richieste del clinico (2)
Risposta non diagnostica Risposta descrittiva: il campione inviato contiene alterazioni aspecifiche, che si possono riscontrare in varie patologie (es. la flogosi). Non si possono pertanto trarre conclusioni precise su una malattia. Risposta non descrittiva: il materiale è in quantità insufficiente, non proviene dalla sede adeguata, non è stato adeguatamente trattato (mal fissato). In questi casi la risposta del patologo contiene l’indicazione all’effettuazione di un nuovo prelievo.

Biopsie escissionali:
Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre all’esame ? (1) Biopsie escissionali: piccoli prelievi di tessuto conseguenti ad un atto chirurgico, Es.: losanghe cutanee asportate per patologie neoplastiche (melanomi, epiteliomi) o infiammatorie (dermatiti). Il numero di biopsie effettuate ed analizzate è direttamente proporzionale all’esperienza del medico che le invia al patologo.

Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre all’esame ?
Biopsia escissionale: Es. resezione cutanea in paziente con dermatofibrosarcoma protuberans

Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre all’esame ? (2)
Agobiopsie Biopsie effettuate con aghi di calibro compreso tra 0,8 e 1,2 mm (14-16 gauche) a mano libera o sotto guida ecografica o TAC. Vengono ottenuti piccoli frammenti di tessuto da inviare al patologo. Solitamente riguardano organi profondi (fegato, rene, prostata).

Biopsie endoscopiche Durante un esame endoscopico (es. gastroscopia o colonoscopia) vengono prelevati frustoli di tessuto attraverso pinze endoscopiche o fibre ottiche. Trova principali applicazioni nella patologia dell’apparato gastroenterico e respiratorio.

Biopsia endoscopica in corso di gastroscopia

Reperti chirurgici Tessuti o organi (interi o in parte) asportati in seguito ad intervento chirurgico. Esaminando il pezzo operatorio il patologo si esprime sulla natura della patologia ma anche sulla completezza dell’intervento chirurgico. Es. resezione intestinale per tumore: valutazione dei margini di resezione, livello di infiltrazione della neoplasia, mappatura dei linfonodi etc.

Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre all’esame ?
Reperti chirurgici Es: asportazione di utero, retto e vescica per carcinoma della cervice uterina localmente avanzato

Esame estemporaneo al congelatore
Anatomia Patologica Quali materiali biologici sottoporre all’esame ? (5) Esame estemporaneo al congelatore Esame patologico di un frammento tissutale che avviene durante l’intervento chirurgico, attraverso il rapido congelamento del frammento stesso. Viene effettuato in pochi minuti per una risposta a determinati quesiti del chirurgo (natura benigna o maligna di una lesione, studio di un margine di resezione, presenza di una metastasi linfonodale etc.). L’esame dà al chirurgo la possibilità di modificare il proprio intervento in itinere

Criostato: strumento che consente Il congelamento rapido di frammenti di tessuto e il successivo taglio di sezioni sottili che opportunamente colorate consentono la diagnosi patologica durante l’intervento chirurgico

Esempio di sezione criostaica

Campioni citologici Agoaspirato L’agoaspirato è il prodotto di un’aspirazione tramite ago sottile (21-23 gauche) infisso in organi o tessuti superficiali o profondi. E’ rapido e indolore, con basso rischio di complicanze e consente di ottenere cellule sulle quali il patologo esprime un giudizio diagnostico. Può essere eseguito a mano libera (es. nodulo tiroideo o mammario) o sotto guida ecografica o TAC (agoaspirato polmonare o epatico o lesione superficiale ma non palpabile

Agoaspirato a mano libera
Agoaspirato a mano libera di nodulo mammario superficiale .

Campioni citologici Aspirati di liquidi da cavità (pleura, pericardio o peritoneo); possono essere eseguiti a paziente sveglio o durante un intervento chirurgico. Escreati, broncoaspirati, lavaggi bronchiali (applicazione in patologia respiratoria) Urine: la raccolta delle urine (in genere in più campioni) è il primo test diagnostico in caso di sospetta neoplasia vescicale o per un controllo dopo terapia della stessa.

Anatomia Patologica Come inviare il materiale
Premessa: qualunque materiale biologico va incontro a più o meno rapida degenerazione e diventa pertanto non più utilizzabile per l’esame patologico Condizione fondamentale per una corretta diagnosi è che il campione pervenga in laboratorio in condizioni ottimali di conservazione

Anatomia Patologica Come inviare il materiale (2)
Campione istologico “fresco” (per esame estemporaneo) Deve essere portato entro pochissimi minuti in laboratorio e viene in genere trasportato in un contenitore avvolto in garza imbevuta di soluzione fisiologica Campione citologico Devono essere conservati in frigorifero a 4° e consegnati il più rapidamente possibile. N.B. I campioni non devono essere mai congelati prima della consegna in laboratorio

Campione istologico tradizionale Il prelievo istologico che deve essere esaminato in via tradizionale (non al congelatore) deve essere “fissato”. La fissazione è un processo che arresta la proteolisi e rende permeabile il tessuto al colorante. N.B. La fissazione errata può danneggiare irreversibilmente la morfologia impedendo una corretta diagnosi patologica ed impedendo l’applicazione di metodiche supplementari d’indagine (es. immunoistochimica)

Sostanze adoperate per la fissazione (in istologia) Formalina: soluzione in acqua (in percentuale variabile dal 35 al 40%) del gas formaldeide; viene usata in soluzione acquosa al 10% (formalina neutra tamponata); è il fissativo più utilizzato Liquido di Bouin: soluzione satura di acido picrico, acido acetico e formalina Glutaraldeide (per la microscopia elettronica) Zenker (mercurio) Carnoy (acido acetico glaciale,etanolo e cloroformio) Per i campioni citologici i fissativi più usati sono l’etanolo 95°, il liquido di Bouin (per gli espettorati) e l’essiccazione all’aria

Fissazione dei tessuti in istologia Il volume del fissativo deve essere di almeno 10 volte superiore al campione La velocità di penetrazione del fissativo nel tessuto è variabile (per la formalina 1mm x ora) La fissazione deve avvenire a temperatura ambiente

Informazioni cliniche:
Anatomia Patologica Quali informazioni devono accompagnare il campione (1) Informazioni cliniche: Sesso ed età del paziente Sede esatta della lesione Rapporto della lesione con organi adiacenti Eventuali patologie concomitanti o pregresse Sintomatologia corrente o pregressa Eventuale esame radiologico (referto) Eventuale familiarità per patologia

Anatomia Patologica Quali informazioni devono accompagnare il campione (2)
La richiesta di esame deve inoltre essere corredata da tutte le informazioni possibili riguardanti il mittente (nome del medico che invia il prelievo, reparto di appartenenza, numeri telefonici etc.) e adeguatamente firmata (in modo leggibile).

Richiesta di esame istologico
Mario Rossi Neoformazione cutanea NO

Richiesta di esame istologico
Mario Rossi 01/01/01 Neoformazione cutanea del III inferiore della gamba destra Neoformazione insorta da ………. Contorni, colore, rilevatezza Eventuale presenza di altre lesioni SI

Richiesta di esame citologico
Mario Rossi Espettorato NO

Richiesta di esame citologico
Mario Rossi 01/01/01 Espettorato Lesione polmonare con caratteristiche radiologiche …………presente da …….. Sintomatologia cliniche (sangue nell’espettorato?? Tosse secca ???, presenza di febbre????, dolori ???? SI

Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione istologico
Descrizione macroscopica e campionamento Descrizione delle caratteristiche macroscopiche del campione (dimensioni, colore, consistenza, aspetto ed estensione delle lesioni presenti). Sezionamento del campione per ottenere prelievi dimostrativi delle lesioni e dei rapporti delle stesse con i tessuti normali circostanti; isolamento delle strutture linfonodali eventualmente presenti; i prelievi ottenuti vengono posti in biocassette e quindi in formalina. Il pezzo operatorio viene in genere manipolato dopo una fissazione di circa 24 ore ma può essere campionato anche fresco

Descrizione macroscopica e campionamento La descrizione macroscopica del pezzo viene in genere riportata insieme alla diagnosi anatomo-patologica (a volte con fotografie allegate) Si può procedere alla marcatura dei margini di resezione con inchiostro di china di vari colori. Questo serve alla valutazione orientata dei margini di resezione in quanto i colori restano sulle sezioni prelevate e permettono di riconoscere i diversi margini e l’eventuale presenza della lesione in corrispondenza di questi

Esame macroscopico in laboratorio

Disidratazione Effettuato il prelievo il tessuto viene completamente disidratato immergendolo in etanolo a concentrazione crescente (da 60 a 100). Successivamente viene fatto passare in un solvente che ne determina la trasparenza (xilolo).

Inclusione Dopo la disidratazione il tessuto viene immerso in paraffina liquida, cera con punto di fusione a 54-58°; con il raffreddamento la paraffina ingloba il tessuto. Ne deriverà un “blocchetto” pronto per il taglio.

Le fasi di processazione e inclusione sono attualmente realizzate tramite apparecchiature automatiche computer-assistite il che assicura una maggiore affidabilità e riproducibilità.

Taglio al microtomo Il microtomo è uno strumento dotato di lama che consente di ottenere dal blocchetto di paraffina sezioni molto sottili (intorno ai 5 micron) adatte alla visione con il microscopio Esistono due tipi principali di microtomo Rotativo automatico A slitta

Effettuato il taglio delle sezioni queste vengono prima distese in un bagno di acqua tiepida, quindi collocate su un vetrino e fatte asciugare in termostato Per permettere al colorante di penetrare nel tessuto si effettua la sparaffinatura in xilolo Quindi si effettua l’idratazione del tessuto immergendo i vetrini in concentrazioni decrescenti di alcol etilico ( )

Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica Campione citologico
In genere il campione citologico viene depositato (“strisciato”) su un vetrino in modo da formare un unico strato di cellule, quindi fissato in etanolo a 95° e quindi colorato

Pap Test (striscio cervico-vaginale) Il vetrino deve essere contrassegnato con cognome e nome della paziente (a matita sulla parte smerigliata del vetrino) e fissato con fissativo spray (cytofix) Il campione così trattato rimane inalterato per diversi giorni

Esame citologico delle urine La raccolta si effettua per tre giorni consecutivi consegnando al laboratorio un campione ogni mattina L’urina raccolta è quella della seconda minzione mattutina (scartando l’urina della notte) L’urina va consegnata entro 1-3 ore dalla raccolta senza aggiungere nessun liquido fissativo.

Escreati bronco-polmonari L’esame viene eseguito su materiale raccolto per tre mattine consecutive. Il materiale si ottiene con un’espettorazione profonda, quello prevalentemente salivare non è idoneo. Viene raccolto in appositi contenitori di plastica. La consegna deve avvenire entro 1-3 ore dalla raccolta

Liquidi di versamenti di cavità sierose (pleurico, peritoneale e pericardici) Il liquido è collocato in contenitori eparinati (possibilmente sodio-eparina) La consegna deve avvenire entro 1-3 ore dalla raccolta

Citologia agoaspirativa I campioni agoaspirativi prelevati altrove devono pervenire come vetrini già strisciati, fissati con citospray. Se la fissazione è avvenuta per immersione in etanolo a 95% i vetrini devono essere consegnati immersi nello stesso liquido Strisci “a secco” (non fissati) essiccati all’aria: non sono raccomandati tranne che per i prelievi da ghiandola salivare e tiroidei comunque in aggiunta agli strisci fissati

Fasi di lavorazione in Anatomia Patologica
Colorazione Le fettine di tessuto ottenute dal taglio del blocchetto di paraffina o le cellule strisciate sono trasparenti (non presentano contrasto apprezzabile dell’immagine). Per definire le diverse parti di tessuto o cellula è necessaria una colorazione adeguata In base alla struttura che lo compone un tessuto assume i coloranti con intensità diversa nelle sue parti

In base alla composizione chimica: Coloranti acidi (colorano il citoplasma cellulare) Coloranti basici (colorano il nucleo cellulare) Coloranti neutri (acido+basico: colorano nucleo e citoplasma)

Principali coloranti in AP Ematossilina*-eosina (istologia) L’ematossilina colora i nuclei in blu-viola L’eosina colora in rosa i citoplasmi, connettivo e le sostanze intercellulari Papanicolau (citologia) miscela di ematossilina, EA50 e Og6 * l’ematossilina è una sostanza estratta dal fusto di una pianta la colorazione avviene tramite il suo prodotto ossidato, l’emateina

Colorazioni speciali Vengono adoperate (in aggiunta all’EE) per dimostrare più selettivamente particolari componenti cellulari o tissutali. Con l’introduzione di tecniche più avanzate il loro uso si è ridimensionato

Colorazioni speciali PAS (acido periodico Schiff) consente di identificare il glicogeno, mucine, glicoproteine, membrane basali e vari miceti (Candida Albicans)

Colorazione PAS in una neoplasia testicolare intratubulare A destra le cellule neoplastiche PAS+ A sinistra l’epitelio normale PAS-

Colorazioni speciali Colorazioni per micro-organismi Coloranti per evidenziare batteri, funghi, parassiti e micobatteri Es. colorazione Ziehl-Neelsen evidenzia i micobatteri della tubercolosi.

Colorazioni speciali Colorazioni per argentaffinità (capacità di una sostanza di ridurre i sali d’argento) e argirofilia (reazione indotta con l’ausilio di una sostanza riducente). Fontana Masson per argentaffinità Grimelius per argirofilia Queste colorazioni sono utili per identificare cellule neuroendocrine e loro derivati neoplastici

Reazione argentaffine di Fontana Masson Evidenzia (in colore bruno) i granuli di secrezione posti nel citoplasma alla base della cellula in un tumore neuroendocrino (carcinoide)

Colorazioni speciali Reticolo: le fibre reticolari sono presenti nei tessuti connettivali umani e composti principalmente da vari tipi di collagene (tipo III e IV). Le colorazioni che evidenziano le fibre reticolari (es. Gomori) vengono adoperate per distinguere neoplasie epiteliali e connettivali, varie neoplasie connettivali tra loro e tra neoplasie invasive e neoplasie non infiltranti (in situ)

Colorazioni speciali Colorazioni tricromiche Consentono di evidenziare contemporaneamente in un tessuto nuclei, citoplasmi e collagene extracellulare

Colorazioni speciali Pearls (emosiderina e altri sali e ossidi di ferro) Fontana Masson (melanina) Von Kossa (depositi di calcio)

Metodiche accessorie Lo sviluppo della tecnologia ha consentito di introdurre in campo diagnostico anatomo patologico una serie di metodiche che permettono una diagnosi più accurata e talora sono utili (in campo oncologico) per definire la prognosi di malattia Immunoistochimica Biologia molecolare Microscopia elettronica

Metodiche accessorie Immunoistochimica
Insieme di tecniche che consentono di identificare nei preparati microscopici prodotti o costituenti molecolari di una cellula attraverso una reazione antigene-anticorpo opportunamente evidenziata. Queste metodiche possono essere applicate a sezioni istologiche incluse in paraffina o su materiale criostatico (da diagnostica intraoperatoria) o su preparati citologici.

La metodica si basa sull’utilizzo di anticorpi specifici (immunoglobuline) diretti contro l’antigene da ricercare che si trova (o dovrebbe trovarsi) nel tessuto indagato o nelle cellule: la reazione antigene-anticorpo, in presenza di particolari cromogeni produce precipitati colorati visibili al microscopio.

L’anticorpo specifico viene definito anticorpo primario; dopo il legame con l’antigene viene posto in incubazione con un anticorpo (secondario) coniugato con un sistema di rivelazione che lega la porzione FC del primario. Il sistema di rivelazione più adoperato è il complesso Avidina Biotina (ABC)

Le metodiche immunoistochimiche hanno trovato ampio utilizzo nella caratterizzazione delle neoplasie solide e del sistema emopoietico Queste metodiche hanno reso obsolete e superate molte delle colorazioni speciali in quanto hanno: Alta sensibilità e specificità Fattibilità su materiale routinario anche d’archivio Ottima correlazione con le osservazioni morfologiche tradizionali Ampio pannello di anticorpi disponibili

Scopi dell’analisi immunoistochimica Diagnostico Prognostico Terapeutico L’insieme dei marcatori espressi costituisce l’immunofenotipo della cellula neoplastica (fenotipo originale + fenotipo indotto dai danni genetici che hanno prodotto la neoplasia)

Anticorpi maggiormente adoperati in IHC Citocheratine: famiglia di proteine fibrose presenti in quasi tutti gli epiteli; ne esistono oltre 20, classificate in base al loro peso molecolare Rappresentano un utile marker della differenziazione epiteliale di un tumore indipendentemente dalla sua origine specie se adoperate in combinazione Es. CK7+CK20+: neoplasie del pancreas e dell’urotelio CK7+CK20-: neoplasie mammella, polmone, endometrio CK 7-CK20+: neoplasie del colon n.b. questi fenotipi sono mantenuti in genere nelle metastasi

Citocheratina in carcinoma del pancreas scarsamente differenziato

Anticorpi maggiormente adoperati in IHC Vimentina: è uno dei principali filamenti citoplasmatici intermedi ed è caratteristica delle cellule di natura mesenchimale come gli endoteli, i fibroblasti e le cellule muscolari GFAP: filamento citoplasmatico tipico delle cellule nervose; viene usata per caratterizzare le neoplasie cerebrali e quelle dei nervi periferici Actina: proteina contrattile responsabile della motilità delle cellule; marker dei tumori muscolari Recettori ormonali: estrogeni e progesterone, espressi dalle neoplasie mammarie ed endometriali

Es. GFAP in astrocitoma (neoplasia maligna cerebrale) Diagnosi differenziale con neoplasie metastatiche al cervello

es. citomegalovirus in colite virale (paz. immunodepresso)

Marcatori neuroendocrini Cromogranina: famiglia di proteine acide (A,B,C) presenti in quasi tutti i tumori neuroendocrini NSE (enolasi neuro specifica):presente in neuroni e cellule nervose Sinaptofisina: presente nelle vescicole pre-sinaptiche ed isolabile nelle neoplasie neuroendocrine di surrene e tiroide La combinazione di questi marcatori consente si caratterizzare gran parte delle neoplasie neuroendocrine di varie sedi corporee

Positività di cromogranina in carcinoma neuroendocrino (carcinoide) dello stomaco

Antigene prostatico specifico (PSA) e Fosfatasi acida prostatica (PAP): sostanze proteiche secrete dal tessuto prostatico normale e neoplastico. Utili per la caratterizzazione del carcinoma prostatico specie se metastatico Il loro dosaggio nel tessuto è un indice utile anche nel caso di ripresa di malattia dopo trattamento

Espressione di PSA nel carcinoma della prostata

Marcatori di proliferazione Ki67 e MIB1, PCNA: anticorpi che legano in genere cellule nella fase proliferativa del ciclo cellulare Presentano buona correlazione con le mitosi cellulari e sono utili per valutare l’indice proliferativo di una neoplasia (generalmente indicativo di aggressività biologica della stessa)

Es. MIB1 espresso in un centro germinativo di un linfonodo

Biopsia colon

Positività di citocheratina

L’uso combinato di più marcatori immunoistochimici può consentire di definire dei fenotipi neoplastici ed associarli a profili di rischio o di responsività a determinate terapie

Carcinoma della mammella La presenza di recettori per estrogeni e progesterone in una neoplasia mammaria definisce una tumore responsivo al trattamento ormonale

Carcinoma della mammella L’espressione in una neoplasia mammaria dell’oncogene CERBB2-NEU definisce un tumore aggressivo con alto rischio di metastasi a distanza ed è in genere associato a recettori ormonali negativi

Immunoistochimica Limiti della metodica
Falsi negativi Perdita dell’antigene per alterazioni del tessuto Concentrazione bassa dell’antigene Impiego di anticorpi non adeguati o a basse concentrazioni Falsi positivi Legami non specifici anticorpo-tessuto Presenza di anticorpi contaminanti nella soluzione impiegata Reattività crociata dell’anticorpo che potrebbe reagire con un antigene diverso da quello ricercato I risultati dell’indagine vanno sempre correlati all’esame morfologico “classico”

Metodiche diagnostiche accessorie
Biologia molecolare Ibridazione in situ PCR (Polymerase chain reaction)

Ibridazione in situ Utilizza la capacità di molecole a singolo filamento di acidi nucleici di legare un filamento complementare Il principio di base è simile all’IHC con gli acidi nucleici che sostituisco le proteine da ricercare Le sonde molecolari devono essere marcate (per la visualizzazione) da un sistema di rivelazione che può essere enzimatico o fluorescente (FISH)

Ibridazione in situ La variante non fluorescente trova la principale applicazione nella ricerca di virus, specie il virus di Epstein Barr L’ Ibridazione fluorescente trova applicazioni nello studio dell’amplificazione genica e nelle traslocazioni cromosomiche (es. nel carcinoma della mammella le pazienti con amplificazioni dell’oncogene Her2-Neu possono essere trattate con il farmaco Herceptin, anticorpo diretto contro l’oncogene stesso)

PCR (Polymerase chain reaction) Tecnica di amplificazione che permette di ottenere un numero di copie di un acido nucleico maggiore di quello di partenza. Il prodotto finale può essere visualizzato tramite coloranti che legano il DNA

PCR (Polymerase chain reaction) L’applicazione pratica più comune è la determinazione della presenza di monoclonalità in una popolazione linfoide. In pazienti portatori di linfomi la PCR consente di valutare popolazioni neoplastiche eventualmente residue dopo la chemioterapia (malattia minima residua)

Microscopia elettronica Utilizza un microscopio ad elevato potere risolutivo in grado di fornire immagini ad altissimo ingrandimento (utilizza un fascio di elettroni al posto della luce) La tecnica necessita di una speciale preparazione del campione: deve essere fissato in glutaraldeide al 2.5%, post-fissato in osmio-tetrossido, incluso in resina termo indurente e colorato con metalli pesanti (piombo) coloranti opachi per gli elettroni

Microscopia elettronica Applicazioni principali * nella diagnosi differenziale di: Neoplasie indifferenziate Neoplasie pleuriche (mesoteliomi vs adenocarcinomi) Neoplasie del mediastino Neoplasie pediatriche a “piccole cellule” Neoplasie neuroendocrine Neoplasie dei tessuti molli * l’avvento dell’immunoistochimica ha ridotto il campo di applicazione della ME

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