CELLULE STAMINALI 1908- Il termine cellula staminale viene utilizzato dallistologo Alexander Makisimov durante un congresso di ematologia 1963- McCulloch.

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1 CELLULE STAMINALI 1908- Il termine cellula staminale viene utilizzato dallistologo Alexander Makisimov durante un congresso di ematologia 1963- McCulloch e Till illustrano la presenza di cellule staminali autorinnovanti nel midollo osseo di topo. CARATTERIZZAZIONE dei vari tipi di cellula staminale UTILIZZO DI CELLULE STAMINALI…ricerca e approcci terapeutici Lucia Verga Falzacappa

2 LeCellule Staminali Le Cellule Staminali Autorinnovamento perpetuare se stesse in maniera indefinita (self-renewal) Potenzialità Differenziarsi in almeno un tipo cellulare maturo Divisione - Simmetrica: cè un equilibrio tra le divisioni che generano due cellule staminali e divisioni che generano due cellule differenzianti - Asimmetrica: ogni divisione genera una cellula staminale e una cellula che entra in un percorso di differenziazione

3 POTENZIALITA TOTIPOTENTE Può differenziare in tutte le cellule di un organismo, comprese quelle di tessuti extra-embrionali PLURIPOTENTE Può dare origine a tutte le cellule di un organismo tranne quelle dei tessuti extra-embrionali MULTIPOTENTE Può dare origine a tutti i tipi di cellule del tessuto da cui deriva UNIPOTENTE Può dare origine ad un solo tipo cellulare

4 CELLULE STAMINALI EMBRIONALI derivano dallInner Cell Mass (ICM) della blastocisti (fecondazione-morula-blastula-impianto nellutero- gastrula) PLURIPOTENTI

5 capaci di dividersi simmetricamente in maniera illimitata senza differenziare possono differenziare in cellule derivanti da tutti e tre i foglietti embrionali (endoderma mesoderma ectoderma) …..

6 possono essere indotte a differenziare (tramite lutilizzo di fattori differenzianti) fattori di trascrizione, come Oct-4, Nanog, Sox2, costituiscono la rete principale di regolazione che assicura la soppressione dei geni che portano alla differenziazione e il mantenimento della staminalità. Marcatori ES. le cellule staminali embrionali si trovano sempre nella fase S del ciclo cellulare …..

7 STAMINALI EMBRIONALI GERMINALI Derivano dal tessuto fetale, specificatamente sono isolate dalle cellule germinali primordiali (5-10 settimane gestazione) delle gonadi embrionali sono cellule PLURIPOTENTI

8 CELLULE STAMINALI ADULTE isolate da vari tessuti sia nel periodo dello sviluppo fetale che adulto adulte: mantenimento omeostasi tissutale fetali: formazione tessuti localizzate in nicchie delimitate e profonde MULTIPOTENTI ….. ma possono trans-differenziare possono proliferare senza differenziare per un lungo periodo ma … vanno incontro a senescenza numericamente scarse se paragonate alle ES (problema nellapproccio terapeutico)

9 ……FONTI DI CELLULE STAMINALI ADULTE sistema nervoso centrale (zona subventricolare, ventricoli, ippocampo) midollo osseo sangue (cellule ematopoietiche) e vasi base della cripta intestinale strato germinativo dellepidermide pancreas muscolo scheletrico cornea-retina cordone ombelicale, gelatina di Wharton polpa dentale

10 NSC- Neural Stem Cells Cellule multipotenti tessuto- specifiche Generano progenitori neurali neuroni astrociti oligodendrociti Prelevate da tessuto fresco di feti abortiti o tessuto adulto Le cellule vengono selezionate sfruttando la presenza di marcatori di superficie come CD133 (FACS)

11 Espansione: epigenetica, prevede lutilizzo di fattori di crescita al terreno di coltura. Propagazione: genetica, le cellule vengono immortalizzate attraverso linserzione di specifici oncogeni…così da poter espandere in maniera indefinita le cellule (v-myc, TERT). …le cellule però possono trasformarsi in senso tumorale. Modificazioni: inserimento gene reporter per marcare le cellule transfettate, per renderle visualizzabili in seguito a trapianto in vivo, per esempio GFP (Green Fluorescent Protein). Differenziamento: aggiunta al terreno di coltura di fattori differenzianti. In questo caso FBS- forscolina-acido retinoico.

12 F7B-NSC derivate da corteccia di feto umano a 8-9 settimane di gestazione immortalizzate attraverso lutilizzo di v-myc GFP positive

13 Cellule Staminali Mesenchimali (MSC) del cordone ombelicale GELATINA DI WHARTON

14 CARATTERISTICHE - Morfologia fibroblastoide - Crescita in adesione in presenza di FBS - - MSC del cordone ombelicale possono differenziare in adipociti, osteociti, condrociti, cardiomiociti - Multipotenti, possono differenziare in neuroni in presenza di: DMSO forscolina, insulina, acido valproico idrocortisone (Woodbury 2000) mercaptoetanolo (Ishii 1993) medium neuronale condizionato (Fu 2004) acido retinoico e NGF (Sanchez-Ramos 2008)

15 PREDIFFERENZIAM ENTO (PRIMING) DIFFERENZIAMENTO (INDUCTION) esposizione a fattori di crescita rimozione dei fattori di crescita somministrazione di un induttore (DMSO) In vitro

16 NESTINA UMCS predifferenziate Terreno normale UMCS predifferenziate Terreno condizionato DAPI Nestin a DAPI Nestin a

17 - Tubulina III - Tubulina III UMCS differenziate Terreno normale UMCS differenziate Terreno condizionato DAPI -Tub III

18 Risultati in vitro Cell replacement!!!...o supporto trofico!!! Sopravvivenza e integrazione Recupero funzionale Differenziamento prevalentemente neuronale

19 PATOLOGIE NEURODEGENERATIVE CENTRALI Malattia di Alzheimer Sclerosi Laterale Amiotrofica Morbo di Parkinson Malattia di Huntington Sistema colinergico Prosencefalo Basale Sistema dopaminergico Substantia Nigra Sistema GABAergico Nucleo Caudato Motoneuroni

20 SISTEMA COLINERGICO (APPRENDIMENTO- MEMORIA) ALZHEIMER SISTEMA NORADRENERGICO (ATTENZIONE- REAZIONI) ALZHEIMER SISTEMA DOPAMINERGICO (MOVIMENTO VOLONTARIO- COMPORTAMENTO- SONNO-UMORE) PARKINSON

21 IN VIVO... MODELLI ANIMALI VOLKENSINA Motoneuroni spinali Animali transgenici (SOD) 192-IgG-saporina colinergico DBH-saporina Noradrenergico 5,7DHT Serotoninergico PATOLOGIE MIDOLLARI PATOLOGIE PERIFERICHE PATOLOGIE CENTRALI Lesione nervo sciatico

22 SOMMINISTRAZIONE TOSSINE

23 Design Sperimentale (patologie sistema colinergico) P5 Lesione P8 Trapianto1 mese PROCESSAMENTO TESSUTI RATTO P8 Lesione P12 Trapianto 1 mese PROCESSAMENTO TESSUTI TOPO

24 EFFICACIA DELLA LESIONE (192-IgG-saporina Mu-p75-saporina)

25 TRAPIANTI IN RATTO

26 TRAPIANTI IN TOPO

27 MODELLO LESIONE MIDOLLARE PD 1 Lesione (VOLKENSINA) Trapianto (UMCS) Trapianto (UMCS) Processamento tessuti Processamento tessuti PD 8 2 Mesi Processamento tessuti

28 MODELLO SLA …. TOPO SODG93A PD 5 Processamento tessuti TRAPIANTO MSC NEONATALE IN VENTRICOLO ROTAROD PROCESSAMENTO TESSUTI

29 ROTAROD TEST VALUTAZIONE RECUPERO MOTORIO

30 Efficacia della Lesione VOLKENSINA Colorazione delle cellule e delle fibre AChE-positive nel tratto lombare del midollo spinale ~80-85%

31 Trapianto delle UMSC

32 DISFUNZIONE NEURALE PERIFERICA LESIONE/TRAPIANTO 5 MESI PROCESSAMENTO TESSUTI TEST FUNZIONALE (FOOTPRINT) (DL-lactide- -caprolactone) copoliestere

33 GAP NERVO SCIATICO

34 FOOTPRINT

35 TERRENO CONDIZIONATO FUNZIONE SUPPORTO TROFICO

36 GRAZIE PER LATTENZIONE!!!!!!!