Next topics…. LC-MS – Prof. Zattoni Orario data n° ore

Presentazione sul tema: "Next topics…. LC-MS – Prof. Zattoni Orario data n° ore"— Transcript della presentazione:

1 Next topics…. LC-MS – Prof. Zattoni Orario data n° ore 12-13 26-11 1
Accoppiamento LC-MS. Componenti di uno spettrometro di massa. Accoppiamento online della MS alla cromatografia liquida con sorgenti ioniche a pressione atmosferica. 11-12 27-11 Doppia spettrometria di massa Analizzatori di massa a quadrupolo, a trappola ionica, a tempo di volo, a trasformata di Fourier. Principi di doppia spettrometria di massa: modalità di acquisizione del segnale e modalità di scansione. Spettrometri di massa ibridi. 11-13 3-12 2 MS di molecole biologiche. Approcci alla MS per la proteomica. Spettrometria di massa di molecole biologiche. Scelta della tecnica di ionizzazione e dell’analizzatore di massa. Considerazioni sulla risoluzione dello spettrometro: massa monoisotopica e massa media. Approcci all’analisi proteomica: Obiettivi dell’indagine proteomica. Proteomica sistematica, funzionale, differenziale. Approcci top-down, bottom-up, shotgun. Frammentazione dei peptidi. Digestione enzimatica. Interpretazione dello spettro di massa di peptidi. 4-12 Accoppiamento della MS con tecniche separative multidimensionali per la proteomica. Approcci gel-based e gel-free. 2D PAGE MS/MS. 2D LC MS/MS. Sequenziamento “de novo” e identificazione da banca dati. Totale ore 5

2 Schema di uno spettrometro di massa
Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione Ioni Ioni torr Campione Sistema di vuoto

3 Classificazione delle sorgenti ioniche
Sorgenti “dure” (elevata frammentazione) Ionizzazione elettronica Sorgenti “molli” (bassa frammentazione) Ionizzazione chimica Desorbimento (MALDI, elettrospray) Fotoionizzazione

4 Stato del campione Sorgente Liquido Elettrospray – nanospray
Sorgenti ioniche Stato del campione Sorgente Liquido Elettrospray – nanospray APCI (atmospheric pressure chemical ionization) APPI (atmospheric pressure photoionization) LC: flussi ~ 0.1 – 1 cm3 min-1. Se l’eluente è acqua, 0.1 cm3 min-1 = 5.6 mmol min-1 = 135 cm3 min-1 (c.n.) Nano-HPLC: flussi ~ 10-4 cm3 min-1  0.1 cm3 min (c.n.)

5 Meccanismo fisico dell’elettrospray
L’applicazione di un potenziale elettrico ad alto voltaggio ad una goccia di liquido ne provoca la frammentazione in goccioline fini. La causa e’ la repulsione elettrostatica tra le cariche che si generano nella goccia.

6 Sistema di nebulizzazione elettrospray
Cono di Taylor Punta dell’ago

7 Sistema di desolvatazione per elettrospray
Gas di trasporto Gocce di circa 1 µm Gas di desolvatazione Liquido di trasporto Campione Cono di Taylor Capillare riscaldato + - 2-6 kV

8 Meccanismo di deplezione degli ioni
Soluzione del campione 4000 V Pressione atmosferica Calore o gas secco Il calore e/o il gas secco causano la riduzione delle dimensioni delle gocce Vapori del solvente Spettrometro di massa Livelli successivi di vuoto (2 torr – 0.1 torr – 0.01 torr) Esplosione Coulombiana Limite di Rayleigh: Limite di dimensioni della al quale si prevede la frammentazione della goccia. q2 = 8π2ε0γd3 q = carica totale della goccia ε0 = permittività elettrica del mezzo γ = tensione superficiale della goccia d = diametro della goccia

9 L’elettrospray genera spettri multicarica
m/z La carica degli ioni è dovuta agli ioni metallici (es Na+) o ai protoni associati alla molecola. Gli addotti carichi sono quindi della forma: (M + H)+, (M + 2H)2+, …, (M + nH)n+

10 Sorgenti ioniche a desorbimento
Desorbimento/ionizzazione laser assistiti da matrice (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) L’analita viene codepositato su un bersaglio con una matrice, scelta per favorire la vaporizzazione dell’analita. Caratteristiche della matrice: Elevata assorbività alla lunghezza d’onda del laser. Massa molare abbastanza bassa da sublimare facilmente. Bassa reattività chimica. Stabilità al vuoto. Le matrici più utilizzate sono acidi aromatici

11 Il processo MALDI Il bersaglio viene colpito da un impulso laser che viene assorbito dalla matrice e provoca la formazione di un plasma contenente gli atomi dell’analita ed atomi e ioni della matrice.

12 MALDI-TOF MS Range di massa fino a 106  Analizzatore a tempo di volo.

13 Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli
Lo spettro di massa Spettro di massa di ioni monocarica (MALDI/TOFMS) Intensità relativa m/z Spettro di massa del batterio intero Escherichia coli

14 MALDI: vantaggi e limitazioni
Poco sensibile alle contaminazioni (sali, tamponi, detergenti ecc.) Solitamente non richiede complessi passaggi di purificazione del campione. Può analizzare velocemente miscele complesse di analiti (lo spettro è facile da interpretare) Non è una sorgente a flusso La ionizzazione è un processo competitivo, per cui la simultanea presenza di più analiti può dare luogo ad interferenze. L’analisi quantitativa è limitata dalla ridotta omogeneità del campione.

15 Schema di uno spettrometro di massa
Computer Segnale Sistema di introduzione Sorgente di ioni Analizzatore di massa Rivelatore Campione (gassoso) Ioni Ioni torr Campione Sistema di vuoto

16 Risoluzione La capacità di uno spettrometro di massa di differenziare le masse è generalmente espressa dalla risoluzione R definita come: R = m/Δm dove Δm è la differenza di massa tra due picchi adiacenti risolti e m è la massa nominale del primo picco (o la media delle masse dei due picchi). Due picchi sono considerati separati se l’altezza della valle tra di essi è inferiore ad una certa percentuale della loro altezza (di solito il 10%). Uno spettrometro con una risoluzione di risolverà due picchi con valori di m/z 400,0 e 400,1 (o di 40,00 e 40,01). Gli spettrometri commerciali hanno R che variano circa tra 500 e

17 Definizione alternativa
Risoluzione Picchi risolti al 10% della valle Picchi risolti al 80% della valle Intensità Definizione alternativa La risoluzione di un picco isolato si può anche definire come larghezza δm del picco al x% dell’altezza. Spesso si prende x = 50%, e δm è la larghezza a metà altezza.

18 Classi di analizzatori di massa
A settore magnetico A doppia focalizzazione A quadrupolo lineare (Q) Trappola ionica a quadrupolo (QIT) A tempo di volo (TOF) A risonanza ciclotronica e trasformata di Fourier (FT-ICR)

19 Analizzatore di massa a quadrupolo
Potenziale nel quadrupolo

20 Traiettorie dello ione
piano xz Traiettoria instabile lungo x, stabile lungo y piano yz piano xz piano yz Traiettoria stabile sia lungo x che lungo y

21 Traiettorie ioniche nella trappola a quadrupolo
Moto degli ioni in direzione z Moto degli ioni in direzione r tempo Gli ioni vengono intrappolati forzandoli su traiettorie chiuse stabili all’interno della trappola. Quando la traiettoria di uno ione diventa instabile, questo esce dalla trappola e viene rivelato.

22 Analizzatore di massa a quadrupolo
Massimo valore m/z ~ 4 000 Risoluzione ~ 3 000 I quadrupoli sono strumenti a bassa risoluzione Si lavora normalmente alla risoluzione di una unità di massa. Leggero, di dimensioni contenute Facile da accoppiare alla cromatografia Efficiente trasmissione degli ioni Necessaria una elevata precisione nell’allineamento delle barre degli elettrodi

23 Analizzatore a tempo di volo (TOF)
Zona di accelerazione con campo elettrostatico E Ioni positivi Sorgente d V = 0 dE = V0 = V V = V0 L

24 Analizzatore di massa a tempo di volo
Massimo valore m/z > Risoluzione fino a 105. Il reflectron consente di: Ridurre le dimensioni Aumentare la risoluzione Ideale accoppiamento con sorgenti pulsate Efficiente trasmissione degli ioni Per la doppia spettrometria di massa può essere accoppiato con altri analizzatori (qTOF)

25 Principi della ICRFT MS
Gli ioni in un campo elettromagnetico si muovono su traiettorie circolari (o a spirale), generando esse stesse una radiazione elettromagnetica. Tale r.e.m. può essere rivelata da un’antenna, generando un segnale che contiene le radiofrequenze di tutti gli ioni in funzione del tempo. Mediante trasformata di Fourier il segnale viene passato dal dominio del tempo al dominio delle frequenze, e di conseguenza al dominio delle masse.

26 Analizzatore a risonanza ciclotronica
Piano di ricezione Piano di emissione

27 Analisi di massa a trasformata di Fourier
Segnale nel dominio del tempo Segnale trasformato nel dominio delle frequenze  m/z

28 Analizzatore di massa a ICR FT
Massimo valore m/z > Risoluzione fino a 106. Possibilità di confinare gli ioni per la MS/MS. Massima accuratezza nella determinazione delle masse. Semplicità nel passaggio da ioni positivi a ioni negativi. Prezzi ancora proibitivi per molte applicazioni (500 –1 400 k€)

29 Doppia spettrometria di massa (MS/MS)
Ionizzazione e frammentazione analisi di massa m/z decomposizione m1

30 Applicazioni della MS/MS
Maggior contenuto di informazioni Studio della struttura Informazioni addizionali per determinare la struttura di uno ione Rivelazione selettiva di uno ione Drastica riduzione delle interferenze Studio delle reazioni ione-molecola

31 MS/MS nello spazio e nel tempo
Cella di collisione MS/MS nello spazio MS/MS nel tempo Tempo 1 Tempo 2 Tempo 3 Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione

32 Combinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Analizzatori ibridi: EBqQ QqTOF MS/MS nel tempo (MSn) Trappola ionica a quadrupolo (max MS8) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo

33 Modalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto Selezione m/z Scansione Scansione dello ione precursore Simbolismo alternativo Analizzatore di massa fisso Spettrometro di massa a scansione Scansione dello ione prodotto Scansione dello ione precursore Scansione di perdita neutra Monitoraggio di reazione selezionata Scansione Selezione m/z Scansione di perdita neutra Scansione m/z = x Scansione m/z = x-a Monitoraggio di reazione selezionata Selezione del precursore m/z = a Selezione del frammento m/z = b

34 Modalità di scansione MS/MS
Scansione dello ione prodotto: consiste nel selezionare uno ione precursore, di m/z fissato, e nella determinazione di tutti gli ioni prodotti dalla frammentazione attivata per collisione (CID). Se nella cella di collisione si usa un gas reagente, si osservano i prodotti di reazione attivate per collisione (CAR). Quando vengono prodotti solo ioni frammento, questa modalità di scansione è detta anche scansione di ioni frammento. Scansione dello ione precursore: consiste nello scegliere uno ione prodotto e nel determinare gli ioni precursori. Permette di identificare gli ioni precursori di un certo frammento. Questa modalità di scansione, che non si può realizzare con la in time MS/MS, richiede la focalizzazione del secondo analizzatore su di uno ione selezionato, e la scansione di massa sul primo analizzatore. Vengono rivelati gli ioni precursori che per reazione o frammentazione producono ioni figlio della massa selezionata.

35 Modalità di scansione MS/MS
Scansione di perdita neutra (NLS): consiste nello scegliere un frammento neutro e nel rivelare tutte le frammentazioni che portano alla perdita di tale frammento. Come nel caso della scansione dello ione precursore, questa modalità non è realizzabile in MS/MS nel tempo. La scansione richiede che entrambi gli analizzatori scandiscano contemporaneamente, ma con una differenza di massa fissa a fra di loro. Quando uno ione di massa m attraversa il primo analizzatore, viene rivelato solo se produce un frammento di massa m – a. Monitoraggio di reazioni selezionate (SRM): consiste nel selezionare una reazione di frammentazione. In questa modalità, entrambi gli analizzatori sono focalizzati su masse selezionate. Non si ha quindi scansione. È analogo al “monitoraggio di ioni selezionati” in spettrometria di massa singola, ma in questo caso gli ioni selezionati dal primo analizzatore danno un segnale solo se producono un certo frammento mediante una certa reazione. L’assenza di scansione permette di aumentare la sensibilità, oltre che la selettività.

36 Combinazioni strumentali per MS/MS
MS/MS con risoluzione nello spazio Settori elettrico-magnetico: EB/EB o BE/BE (max MS4). Triplo quadrupolo: QqQ Tempo di volo lineare/reflectron: TOF/TOF. Combinati: EBqQ QqTOF MS/MS con risoluzione nel tempo (MSn) Trappola ionica a quadrupolo (max MS8) Risonanza ciclotronica (ICR FTMS) Combinati: Qq(trap) MSn nello spazio e/o nel tempo

37 MS di molecole biologiche
Classi di biomolecole Proteine - Peptidi Acidi nucleici Polisaccaridi Lipidi Tecniche MS Sorgenti: (FAB), MALDI, ESI Analizzatori: TOF, quadrupolo (con ESI), FT ICR, ibridi Tecniche separative HPLC, SEC, CZE, elettroforesi su gel.

38 I progetti -OMICI Genoma Trascrittoma Proteoma
Identificare tutta la serie di ordini che il codice genetico può impartire ad una cellula, per comprendere e prevenire situazioni patologiche Trascrittoma Identificare e quantificare tutta la serie di ordini che il genoma impartisce effettivamente alla cellula, per comprendere ed eventualmente correggere le modalità di regolazione genica Proteoma Caratterizzare e quantificare il contenuto proteico di un sistema cellulare, mediante la determinazione di profili di espressione differenziati nel tempo e nello spazio, comprensivi delle informazioni sulle interazioni molecolari

39 Scelta della tecnica MS

40 Massa monoisotopica e massa chimica
Massa monoisotopica (picco 12C): Massa media (picco 12C): Per peptidi e proteine la differenza fra massa media (chimica) e massa mono-isotopica è circa 0.06%, distinguibile se lo spettrometro ha risoluzione pari a: R = 100/0.06 = 1667 (nell’esempio sopra, R = 5000)

41 Identificazione del picco 12C
Insulina Albumina bovina Per piccoli peptidi il primo picco, relativo alla massa monoisotopica, è anche quello più intenso. Questo non è vero per proteine di massa maggiore, in cui il picco 12C può essere poco intenso o addirittura non rivelabile. Oltre un certo valore di massa, il dato analitico utile è la massa media, che si ricava dal centroide del picco.

42 Risoluzione e sensibilità
Quando non è possibile raggiungere risoluzione unitaria, ed identificare il picco di massa monoisotopica, è poco conveniente superare la risoluzione alla quale si può determinare la massa media con accuratezza. Questo è vero in particolare quando si deve raggiungere un compromesso fra risoluzione e sensibilità

43 Ruolo della MS in proteomica
Proteomica sistematica Identificazione e sequenziamento di tutte le proteine contenute in una cellula. (MS o MS/MS accoppiata a 2D PAGE o 2D LC per l’analisi strutturale di miscele di peptidi e proteine intere) Proteomica differenziale Studio delle differenze rilevabili fra il proteoma di una cellula sana e quello di una cellula malata (2D PAGE + MS o MS/MS per la determinazione di mutazioni nella sequenza, modifiche post-traduzionali, modifiche conformazionali, sovra o sottoespressione) Proteomica funzionale Studio della funzione biologica delle proteine e delle loro interazioni con proteine e peptidi (Separazione in condizioni non denaturanti + MS di proteine e complessi proteici allo stato nativo)

44 Strategie proteomiche basate sulla MS
Proteina (sconosciuta) 2D SDS PAGE bottom-up Top-down digestione Miscela di peptidi Massa dei peptidi mediante LC/LC/ESIMS shotgun Ricerca dei pesi molecolari in banca dati Massa di proteine intere mediante (LC)ESI/MS sconosciuta nota Sequenziamento in MSn sconosciuta MSn per ulteriori Informazioni sulla sequenza Identificazione e caratterizzazione di proteine nota Ricerca dei pesi molecolari in banca dati

45 Approccio proteomico top-down
Si basa sulla determinazione della massa accurata (media) delle proteine in una matrice di complessità ridotta (ottenuta per purificazione con metodi biochimici o per separazione con tecniche non denaturanti) Permette di determinare la conformazione delle proteine nel loro stato nativo, e le interazioni proteina-proteina (complessi proteici fra biomarker e proteine di trasporto, oligomeri funzionali) Permette di determinare la composizione amminoacidica della proteina, ma non la loro sequenza Non identifica la proteina in modo univoco in un proteoma complesso Permette di studiare isoforme (mutazioni di singoli amminoacidi) e modificazioni post-traduzionali, ma non di localizzarle.

46 Approccio proteomico top-down
Spettro m/z in ESI/qTOF di perossidasi di rafano (HRP) allo stato nativo Il software dello spettrometro di massa identifica le famiglie di picchi negli spettri multicarica sovrapposti, ne determina il valore di m/z medio (il centroide del picco) e calcola lo spettro di massa ricostruito

47 Approccio proteomico top-down
B C D E F 2Ca2+ Glicosilazione Sullo spettro di massa ricostruito si possono identificare isoforme, complessi metallo-proteina e modificazioni post-traduzionali

48 LC-MS/MS per l’identificazione “de novo” della sequenza peptidica
m/z 600 200 1000 y2 b3 y3 y4 y5 b7 y7 b8 y6 b9 y9 y10 b11 b12 MS/MS MS trace MS/MS trace 30 40 50 Time [min]

49 Masse degli aminoacidi
Aminoacido Codice (3 lettere) Codice (1 lettera) Massa monoisotopica Massa chimica Glicina Gly G 57.052 Alanina Ala A 71.079 Serina Ser S 87.078 Prolina Pro P 97.117 Valina Val V 99.133 Treonina Thr T Cisteina Cys C Isoleucina Ile I Leucina Leu L Asparagina Asn N Aspartato Asp D Glutammina Gln Q Lisina Lys K Gluatammato Glu E Metionina Met M Istidina His H Fenilalanina Phe F Arginina Arg R Tirosina Tyr Y Triptofano Try W

50 Frammentazione dei peptidi
x3 y3 z3 x2 y2 z2 x1 y1 z1 R1 R2 R3 R4 O O O O H2N-CH C NH CH C NH CH C NH CH-COH a1 b1 c1 a2 b2 c2 a3 b3 c3 R4 R1 R2 + + R3 O O O O C NH CH C NH3 CH C NH CH-COH H2N-CH b2 y”2

51 Interpretazione dello spettro di massa di peptidi

52 Modifiche post-traduzionali
Glicosilazione Variabile ( >3000 Da) Fosforilazione Da Acetilazione Da Formilazione Da Ossidazione Da Riduz. ponti disolfurici Da Ancora glicolipidica Variabile

53 Identificazione di siti modificati
Peso Molecolare Proteina Intatta Coincide con valore atteso? No Sì Proteina sbagliata Mutazione Modifica post-traduz. Peptide Mapping Peptide/i modificato/i MS/MS Identificazione Sito/i modificato/i

54 Proteomica bottom-up identificazione della proteina
Elettroforesi bidimensionale (2D PAGE) 1000 1500 2000 Mass (m/z) estrazione dei peptidi analisi MALDI/TOFMS taglio degli spot; digestione con tripsina identificazione della proteina

55 + H R-C N-R’ O H R-C-OH H N-R’ O Digestione enzimatica proteina
legame peptidico H R-C N-R’ *alcuni enzimi proteolitici specifici sono: tripsina tagli specifici solo a Lys-X o Arg-X Lys-C Lys-X Arg-C Arg-X Glu-C (V-8) Glu-X and Asp-X O Enzima * proteolitico H2O H + (frammenti proteolitici) R-C-OH H N-R’ O

56 Identificazione di peptidi in banca dati
È la più comune procedura per l’identificazione dei peptidi mediante spettrometria di massa La lista dei pesi molecolari ottenuta dall’analisi MALDI/TOFMS viene inserita in banca dati per l’identificazione della proteina incognita. Solitamente i segnali dei picchi a basso peso molecolare (< 500 Da) vengono esclusi dalla ricerca in quanto potrebbero essere segnali di matrice.

57 Digestione automatizzata: MALDI prep
Procedura di identificazione automatizzata Digestione automatizzata: MALDI prep Spot Cutter 2D GEL MALDI/TOF MS Risultati elaborazione dei dati e ricerca in banca dati

58 Vantaggi e limiti dell’elettroforesi
L’elettroforesi bidimensionale è oggi la più potente tecnica separativa utilizzata per le proteine, tuttavia essa presenta una serie di svantaggi: E’ ristretta a proteine in un intervallo di masse molecolari tra 104 e 106 Da Non è possibile rivelare proteine poco espresse (bassa sensibilità) Bassa riproducibilità da gel a gel Lo spettrometro di massa non può essere interfacciato on-line con la tecnica separativa.

59 Una alternativa alla 2D PAGE
Cromatografia bidimensionale Una alternativa alla 2D PAGE In cromatografia multidimensionale due (o più) tecniche con proprietà “ortogonali” vengono combinate per migliorare la separazione Separazioni cromatografiche 1000 1500 2000 Mass (m/z) (*) Analisi di massa Raccolta di frazioni (*)digestione proteolitica

60 LC/LC MSn per l’analisi di miscele di peptidi
frazione 1 frazione 2 minuti prima dimensione: cromatografia a scambio ionico diverse frazioni di peptidi vengono eluite effettuando un gradiente di tampone salino a valori crescenti di forza ionica.

61 LC/LC MSn per l’analisi di miscele di peptidi
Seconda dimensione: cromatografia a fase inversa (C4 – C18) Ciascuna frazione contenente i peptidi eluiti dalla colonna a scambio ionico viene ulteriormente separata su una colonna cromatografica a fase inversa e i singoli peptidi sono rivelati e identificati utilizzando uno spettrometro di massa ESI-Q/TOF in modalità MS/MS