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FACOLTร€ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI

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Presentazione sul tema: "FACOLTร€ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI"โ€” Transcript della presentazione:

1 Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale
FACOLTร€ DI SCIENZE MATEMATICHE, FISICHE E NATURALI CORSO DI LAUREA IN FISICA Relatore: Prof. Tullio Scopigno Correlatore: Dott.ssa Abigail Nunn Candidato: Saltarelli Francesco Anno Accademico 2013/14 Roma, 26 Settembre 2014

2 Introduzione Negli epatociti vi puรฒ essere un accumulo anomalo di lipidi sotto forma di goccioline: dovuto a patologie (steatosi epatica, cancro) indotto esternamente (acido oleico, entinostat) Attraverso degli script in ambiente Matlab andremo ad analizzare la disposizione di tali goccioline seguendo le fasi indicate: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ)/ ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.In questa dissertazione siamo partiti da immagini di epatociti ossia le cellule maggiormente presenti nel fegato e abbiamo studiato lโ€™accumulo lipidico che in esse si forma. Tale accumulo puoโ€™ essere dovuto a patalogie o, come nel nostro caso, stimolato da un trattamento con specifiche sostanze come lโ€™acido oleoico, un acido grasso, o lโ€™entinostat, un medicinale sperimentale anticancro. Nelle immagini vediamo il raffronto fra un fegato sano con un minimo accumulo lipidico ed uno malato di steatosi epatica dove sono presenti accumuli di lipidi 1.Quello che abbiamo fatto eโ€™ stato sviluppare un metodo per studiare la disposizione di tali gocce attraverso il calcolo della funzione di distribuzione radiale con opportuni script in matlab 2.Inizieremo spiegando brevemente le tecniche con cui tali immagini sono state acquisite e termineremo mostrando i risultati ottenuti per una cellula Healthy liver Fatty liver Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

3 Diffusione a singolo fotone da parte di una molecola:
Elastica โ†’ Rayleigh Anelastica โ†’ Raman Diffusione a piรน fotoni: CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering): ๐œ” ๐‘Ž๐‘  =2โ‹… ๐œ” ๐‘ โˆ’ ๐œ” ๐‘  Nei lipidi si sfrutta la riga vibrazionale di stretching del legame ๐ถ๐ป a: ๐œ” ๐‘ โˆ’ ๐œ” ๐‘  =ฮฉ=2841๐‘ ๐‘š โˆ’1 FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0. Le immagini degli epatociti sono state acquisite con un microscopio CARS. Per capire, in breve, in cosa consiste consideriamo la DIFFUSIONE DI FOTONI da parte di una MOLECOLA. Se tali fotoni hanno ENERGIA insufficiente a causare transizioni elettroniche ma superiore a quella per portare il sistema al primo livello vibrazionale eccitato il sistema si porteraโ€™ in uno stato virtuale da cui ricadraโ€™ con massima probabilitaโ€™ nello stato fondamentale e raramente nel primo stato vibrazionale eccitato emettendo dunque un fotone a frequenza piuโ€™ bassa. Tale diffusione eโ€™ note come Stokes Scattering. La differenza di frequenza fra fotone emesso e ricevuto ci indica il salto energetico del primo livello vibrazionale eccitato rispetto allo stato fondamentale e dunque CARATTERIZZA la MOLECOLA investita dal fascio. Analogamente eโ€™ anche possibile che il sistema parta dallo stato vibrazionale eccitato, vada in uno stato virtuale e dunque ricada nello stato fondamentale, cioโ€™ eโ€™ noto come Anti-Stokes Scattering. La probabilitaโ€™ dello scattering di anti-stokes rispetto allo stokes dipende dalla popolazione termica iniziale dello stato fondamentale e del primo eccitato. 1.Lโ€™effetto Raman consente di individuare le molecole investite dal fascio ossia ha SELETTIVITAโ€™ CHIMICA ma eโ€™ molto debole; tuttavia inviando due fasci sulla molecola distanziati in frequenza di una quantitaโ€™ pari al salto en vibrazionale fra stato fondamentale e primo eccitato, grazie ad un fenomeno di OTTICA NON LINEARE che implica unโ€™interazione a piuโ€™ fotoni abbiamo che il segnale di ANTI-STOKES eโ€™ emesso molto piuโ€™ INTENSAMENTE consentendo dunque lโ€™uso di tale tecnica per fini di microscopia. 2.Nel caso dei LIPIDI la distanza in frequenza fra fascio di pump e stokes deve essere di 2841 cm^-1 ossia il salto vibrazionale di stretching del legame CH presenti nel gruppo CH_2 dei lipidi Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

4 Schema microscopio invertito CARS
FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Fasci di pump e stokes fatti coincidere spazialmente (COLLIMATI) e temporalmente (LINEA DI RITARDO) 1.3D ottenuto MUOVENDO il FUOCO allโ€™interno del campione, lo possiamo ottenere muovendo il campione o lโ€™obiettivo, noi optiamo per la seconda Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

5 Stack di immagini associato ad una cellula
(trattamento: acido oleico + entinostat) FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Lโ€™immagine completa viene ritagliata attorno ad ogni cellula dopo lโ€™applicazione di un filtro per ridurre il rumore. Distanza fra due layer in z di 0,3um 1.FORMA non ben definita 2.NUCLEO 3.Gocce piuโ€™ esterne al nucleo compaiono prima di quelle piuโ€™ interne -> coordinata Z diversa Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

6 Nella fase di processing otteniamo dallo stack di immagini acquisite al microscopio posizione e area di ogni goccia per ogni layer Threshold: si fissano due soglie, i pixel con un'intensitร  al loro interno rappresentano il segnale, gli altri lo sfondo nero Watershed: divide le gocce rimaste unite cercando il loro centro e dilatandolo fincheโ€™ incontra unโ€™altra goccia o raggiunge il limite della goccia stessa a cui il centro appartiene FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Nella fase di PROCESSING dallo stack di immagini otteniamo posizione e area di ogni particella per ogni layer 1.In prima istanza si esegue un threshold dellโ€™immagine con cui dallโ€™immagine in scala di grigi passiamo ad una binaria. Cioโ€™ si ottiene fissando due soglie e tenendo come segnale solo i pixel che ha unโ€™intensitaโ€™ compresa fra queste due soglie, il risultato lo vediamo nellโ€™immagine in mezzo. Infine, attraverso il watershed si cercano di individuare i centri delle gocce e dunque di dividere quelle rimaste unite nel thresholding Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

7 FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Eseguendo threshold e watershed con i tool integrati in Fiji siamo costretti a scegliere delle soglie GLOBALI per lโ€™intero stack di immagini. Cioโ€™ eโ€™ piuttosto problematico infatti tali soglie vanno scelte cercando da un lato di identificare ogni goccia e dallโ€™altro di dividere le gocce piuโ€™ grandi e vicini, risultati che si ottengono con impostazioni opposte 1.Per superare tale problema possiamo sfruttare un plugin esterno che sceglie in automatico una soglia di threshold locale ottimale per ogni goccia. Cioโ€™ eโ€™ fatto analizzando lโ€™intero stack di immagini e facendo in moto che ogni goccia risulti il piuโ€™ grande possibile pur rimanendo distinguibile da quelle vicine 2.Dal confronto proposto si vede come il plugin esterno distingua piuโ€™ chiaramente le gocce e dunque lo abbiamo preferito ai tool integrati in Fiji Algoritmo interno Fiji: si fissa una soglia di threshold uguale per lโ€™intero stack e poi si esegue il watershed 3D Iterative Thresholding plugin: sceglie una soglia di threshold diversa per ogni goccia seguendola sullโ€™intero stack di immagini e tiene quella che massimizza il volume Il plugin esterno ha prestazioni migliori in termini di capacitร  di distinguere le gocce e stimarne le dimensioni Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

8 Inseguimento di una goccia: Dato un certo layer ๐‘™ e su di esso una goccia ๐‘– si va a calcolare per ogni goccia ๐‘— sul layer seguente piรน interno la quantitร : ๐‘‘ ๐‘–,๐‘— ๐‘™ = ๐‘ฅ ๐‘– ๐‘™ โˆ’ ๐‘ฅ ๐‘— ๐‘™ ๐‘ฆ ๐‘– ๐‘™ โˆ’ ๐‘ฆ ๐‘— ๐‘™+1 2 ( ๐‘Ÿ ๐‘– ๐‘™ + ๐‘Ÿ ๐‘— ๐‘™+1 ) Le gocce ๐‘– e ๐‘˜ sono identificate come la stessa su layer diversi se: ๐‘‘ ๐‘–,๐‘˜ ๐‘™ <1 โ†’ si sovrappongo ๐‘‘ ๐‘–,๐‘˜ ๐‘™ = min ๐‘— ๐‘‘ ๐‘–,๐‘— ๐‘™ โ†’ la zona di sovrapposizione รจ massima FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Presenta d_{i,j}^l e CONDIZIONI per cui due gocce sono considerate la stessa su layer diversi 1.Come si vede dallโ€™immagine a sinistra, immaginando che le gocce di lipidi siano pressocheโ€™ sferiche, abbiamo che lโ€™area apparente con cui esse compaiono sui layer (ossia quella evidenziata in verde) eโ€™ minore di quella massima (arancio) quando il layer non taglia la goccia per il centro. 1. Andando dunque a graficare lโ€™area apparente in funzione del layer e interpolando il massimo con una parabola, otteniamo la coordinata z del centro e lโ€™area massima da cui il raggio della goccia Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

9 Mappa delle gocce di lipidi in una cellula
FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.La Z eโ€™ indicata con il colore 1.Piccola escursione della z rispetto a xy -> STRUTTURA PLANARE della cellula 2.Particelle vicine tendono ad avere lo stesso colore, SPECIFICO di QUESTA CELLULA Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

10 ๐‘” ๐‘Ÿ โ†’ con ๐‘Ÿ distanza fra i centri delle particelle
La funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ , in un sistema di particelle, descrive come varia la densitร  in funzione della distanza da una particella presa come riferimento ๐‘” 2๐ท ๐‘Ÿ+ ๐‘‘๐‘Ÿ 2 = 1 ๐œ‹[ ๐‘Ÿ+๐‘‘๐‘Ÿ 2 โˆ’ ๐‘Ÿ 2 ] โ‹… 1 ๐‘๐œŒ ๐‘– ๐‘› ๐‘– (๐‘Ÿ,๐‘Ÿ+๐‘‘๐‘Ÿ) ๐‘” 3๐ท ๐‘Ÿ+ ๐‘‘๐‘Ÿ 2 = ๐œ‹[ ๐‘Ÿ+๐‘‘๐‘Ÿ 3 โˆ’ ๐‘Ÿ 3 ] โ‹… 1 ๐‘๐œŒ ๐‘– ๐‘› ๐‘– ๐‘Ÿ,๐‘Ÿ+๐‘‘๐‘Ÿ FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐’ˆ ๐’“ / ๐’ˆ ๐’… Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Introduci la g(r) 1.Formula: Sommiamo su ogni particella il numero di vicini a distanza compresa fra r e r+dr, quindi dividiamo per N al fine di avere il numero medio di vicini a quella distanza. La divisione per il volume/area ci restituisce dunque la densitaโ€™ e la divisione per rho ce la normalizza alla densitaโ€™ media. Dunque per distanze grandi fra le particelle dove nn ci sono correlazioni ci aspettiamo che la g(r) vada ad 1 2.Oltre a calcolare la g(r) con la distanza fra i CENTRI delle particelle introduciamo anche una funzione che chiamiamo g(d) dove con d indichiamo la distanza fra i BORDI delle particelle e dunque atta a mettere in evidenza eventuali strutture caratteristiche nella distanza fra i bordi delle particelle ๐‘” ๐‘Ÿ โ†’ con ๐‘Ÿ distanza fra i centri delle particelle ๐‘” ๐‘‘ โ†’ con ๐‘‘ distanza fra i bordi delle particelle Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

11 Nel caso di volume finito possiamo:
tenere conto del volume effettivo in cui cerchiamo vicini per le particelle al bordo; introdurre PBC (minimum image convention) Ciรฒ non รจ applicabile al caso delle cellule dove il bordo non รจ ben definito FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Lavorano in un volume finito o area come nel caso dellโ€™immagine in alto vediamo che fissata una certa corona circolare in cui cerchiamo vicini, per le particelle centrali, come quella rossa, avremo che tale corona eโ€™ tutta contenuta nellโ€™immagine; differentemente, per quella blue, abbiamo che la parte viola di corona non eโ€™ contenuta nellโ€™immagine e dunque non va considerata nel denominatore per il calcolo della g(r) 1.Alternativamente potremmo definire PBC e immaginare di replicare lโ€™area in cui abbiamo fatto evolvere le particelle in un reticolo, in tal modo, secondo la minimum image convention, ogni particella interagisce con lโ€™immagine piuโ€™ vicina delle altre particelle 2.Tutto cioโ€™, che applicheremo al caso di una simulazione LJ per verificare gli script sviluppati, non eโ€™ utilizzabile nel caso delle cellule dove il bordo non eโ€™ neanche ben definito Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

12 ๐‘” ๐‘Ÿ per particelle puntiformi uniformemente distribuite:
con PBC โ†’ costante al valore 1 senza PBC โ†’ decadimento anomalo, previsto analiticamente tenendo presente lโ€™area effettiva dove vengono cercati vicini per le particelle al bordo FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite ๐‘” ๐‘ข๐‘›๐‘–๐‘“ 2๐ท ๐‘Ÿ = 1 ๐‘™ ๐‘ฅ โ‹… ๐‘™ ๐‘ฆ โ‹… 2๐‘Ÿโ‹… ๐‘™ ๐‘ฅ โˆ’2๐‘Ÿ โ‹… 1โˆ’ 1 ๐œ‹ + ๐‘™ ๐‘ฆ โˆ’2๐‘Ÿ โ‹… ๐‘™ ๐‘ฅ โˆ’ 2๐‘Ÿ ๐œ‹ + +4โ‹… ๐‘ฅ<๐‘Ÿ ๐‘ฆ<๐‘Ÿ ๐‘ฅ 2 + ๐‘ฆ 2 > ๐‘Ÿ โˆ’ cos โˆ’1 ( ๐‘ฅ ๐‘Ÿ ) ๐œ‹ โˆ’ cos โˆ’1 ( ๐‘ฆ ๐‘Ÿ ) ๐œ‹ โ…†๐‘ฅโ…†๐‘ฆ + +4โ‹… ๐‘ฅ<๐‘Ÿ ๐‘ฆ<๐‘Ÿ ๐‘ฅ 2 + ๐‘ฆ 2 < ๐‘Ÿ โˆ’ cos โˆ’1 ( ๐‘ฅ ๐‘Ÿ ) 2๐œ‹ โˆ’ cos โˆ’1 ( ๐‘ฆ ๐‘Ÿ ) 2๐œ‹ โ…†๐‘ฅโ…†๐‘ฆ 0.Calcoliamo la g(r) per particelle puntiformi disposte uniformemente in una scatola: qualsiasi regione consideriamo il numero di particelle presente saraโ€™ in media dato dalla densitaโ€™ moltiplicata per il volume della regione. Se si inseriscono PBC otteniamo una funzione costante al valore 1 (linea viola), se non le mettiamo e non correggiamo lโ€™area al denominatore otteniamo un decadimento anomalo (linea rossa) che possiamo prevedere con un calcolo analitico dove teniamo conto dellโ€™area (linea verde) Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

13 ๐‘” ๐‘๐‘œ๐‘Ÿ๐‘Ÿ๐‘’๐‘๐‘ก๐‘’๐‘‘ ๐‘Ÿ = ๐‘” ๐‘Ÿ๐‘Ž๐‘ค ๐‘Ÿ โˆ’ ๐‘” ๐‘ข๐‘›๐‘–๐‘“ ๐‘Ÿ +1
Per particelle che evolvono in un certo volume potremo correggere la ๐‘”(๐‘Ÿ) ottenuta senza PBC detta ๐‘” ๐‘Ÿ๐‘Ž๐‘ค ๐‘Ÿ , calcolando la ๐‘” ๐‘ข๐‘›๐‘–๐‘“ (๐‘Ÿ) ossia la ๐‘”(๐‘Ÿ) per particelle puntiformi disposte uniformemente nello stesso volume: ๐‘” ๐‘๐‘œ๐‘Ÿ๐‘Ÿ๐‘’๐‘๐‘ก๐‘’๐‘‘ ๐‘Ÿ = ๐‘” ๐‘Ÿ๐‘Ž๐‘ค ๐‘Ÿ โˆ’ ๐‘” ๐‘ข๐‘›๐‘–๐‘“ ๐‘Ÿ +1 FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Lโ€™idea eโ€™ dunque quella di, dato un volume, prevedere il decadimento anomalo che avraโ€™ la g(r) calcolando tale funzione per particelle uniformemente distribuite nello stesso volume, chiameremo tale funzione g_unif(r). Possiamo dunque correggere la g(r) calcolata senza PBC, indicata con g_raw(r) sulla base della g_unif(r) secondo la formula indicata 1.Al fine di ridurre il rumore presente nella g_unif tale funzione viene calcolata su molte configurazioni diverse che vengono poi mediate 2.In figura vediamo come la g_corrected rispecchi gli stessi picchi della g(r) calcolata con PBC Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

14 Nel caso delle cellule resta il problema di definire unโ€™area effettiva, ossia una zona dove la distanza fra le gocce รจ paragonabile alle dimensioni stesse di queste ultime; lo facciamo dividendo lโ€™immagine in rettangolini e stabilendo una densitร  di soglia FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐’ˆ(๐’“) / ๐’ˆ(๐’…) Applicazione a immagini acquisite 0.Ottenuto dunque un metodo per normalizzare la g(r) resta il problema di definire il volume effettivamente occupato dalle cellule 1.A tale fine, in 2D, dividiamo lโ€™immagine in rettangolini di dimensioni 4-5 volte il raggio medio di una cellula e andiamo a tenere o meno tali rettangolini fissando una denistaโ€™ di soglia minima. Nellโ€™immagine vediamo ombreggiata lโ€™area efficace della cellula cosiโ€™ identificata. In tale area saranno disposte particelle puntiformi uniformemente al fine di calcolare la g^unif(r) 2.Tale procedura viene effettuata anche in 3D utilizzando parallelepipedi al posto di rettangolini Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

15 ๐’ˆ(๐’“) calcolata in 2D FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing
Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Vediamo dunque la g(r) calcolata in 2D, ossia sulla proiezione sul piano delle gocce viste nella slide precedente (stiamo semplicemente trascurando la coordinata z). Si noti come la g_unif(r) rispecchia lโ€™andamento della g(r) grezza. In tal caso il calcolo in 2D eโ€™ ragionevole in quanto gocce vicine hanno sostanzialmente la stessa coordinata z e dunque la correzione dovuta alla terza dimensione eโ€™ piccola 1.Eโ€™ ben distinto il primo picco e si vede un secondo picco Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

16 ๐’ˆ(๐’…) calcolata in 2D FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing
Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0. Calcolando la g(d), dove d ricordiamo eโ€™ la distanza fra i bordi delle particelle, abbiamo una notevole pulizia del segnale dove si evidenziano bene primo e secondo picco mentre il terzo eโ€™ solo accennato. In particolare il primo picco eโ€™ centrato a circa 0.2um, le gocce tendono dunque a tenersi leggermente separate le une dalle altre. Cioโ€™ eโ€™ in accordo con il fatto che nelle cellule i lipidi sono circondati da PROTEINE Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

17 ๐’ˆ(๐’“) calcolata in 3D FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing
Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Il calcolo eโ€™ ora in 3D dunque usando anche la coordinata z nel conto della distanza 1.Notiamo come andando oltre 1.5um la funzione sia sostanzialmente piatta, cioโ€™ eโ€™ dovuto al fatto che essendo lโ€™estensione in z della cellula inferiore ai 3-4um quando andiamo a cercare vicini per r troppo grande la maggior parte della corona sferica cade al di fuori della cellula e dunque non mostra alcun particolare interessante Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

18 ๐’ˆ(๐’…) calcolata in 3D FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing
Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Anche in 3D, la g(d) rispetto alla g(r) risulta in una pulizia del segnale Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

19 Cellula trattata con acido oleico e entinostat
FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Anche in 3D, la g(d) rispetto alla g(r) risulta in una pulizia del segnale Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

20 Cellula trattata con acido oleico
FASI DELLโ€™ANALISI: Acquisizione Processing Threshold e Watershed Identificazione delle gocce in 3D Calcolo funzione di distribuzione radiale ๐‘” ๐‘Ÿ / ๐‘” ๐‘‘ Problema PBC Test su simulazione LJ Correzione ๐‘”(๐‘Ÿ) / ๐‘”(๐‘‘) Applicazione a immagini acquisite 0.Anche in 3D, la g(d) rispetto alla g(r) risulta in una pulizia del segnale Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014

21 Prospettive future La funzione di distribuzione radiale ha delle caratteristiche peculiari che rispecchiano aspetti osservabili qualitativamente nelle immagini come: presenza di picchi โ†’ ordine nella disposizione delle gocce posizione dei picchi โ†’ disposizione piรน o meno compatta delle gocce larghezza dei picchi โ†’ diversitร  nelle dimensioni delle gocce Lโ€™idea, a lungo termine, รจ quella di costruire una banca dati con tali informazioni e confrontare la risposta delle cellule a diversi trattamenti, al fine di avere piรน chiaro il loro effetto 0.Aver ottenuto la funzione di distribuzione radiale per le gocce di lipidi nelle cellule ci consente di trasformare osservazioni qualitative sulla disposizione di tali gocce in parametri quantitativi facilmente confrontabili per cellule diverse 1.La presenza di piuโ€™ o meno picchi rispecchia un ordinamento maggiore o minore di tali gocce; la posizione dei picchi indica una struttura piuโ€™ o meno compatta mentre la larghezza, per la g(r) eโ€™ legata a quanto varia la dimensione delle gocce 2.A lungo termine lโ€™idea eโ€™ quella di costruire una banca dati con queste informazioni mettendole in relazione al particolare trattamento a cui una cellula eโ€™ stata sottoposta al fine di comprendere meglio gli effetti di questโ€™ultimi Analisi statistica di accumulo lipidico in epatociti determinato mediante imaging vibrazionale 26/9/2014


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