Luisa Manninaa,b , Marco D’Imperioa Anatoli Sobolevb, Annalaura Segreb

Presentazione sul tema: "Luisa Manninaa,b , Marco D’Imperioa Anatoli Sobolevb, Annalaura Segreb"— Transcript della presentazione:

1 OLIO DI OLIVA: CARATTERIZZAZIONE ATTRAVERSO L’NMR AD ALTA RISOLUZIONE ( 1H e 13C)
Luisa Manninaa,b , Marco D’Imperioa Anatoli Sobolevb, Annalaura Segreb a Università degli Studi del Molise, Isernia, Italy b Istituto di Metodologie Chimiche, CNR, Monterotondo Stazione, Roma, Italy

2 REGOLAMENTO (CEE) n. 2568/91 Analisi Chimiche: acidità libera (% di acido oleico) numero di perossidi (meq/O2 Kg) Analisi Spettrofotometriche (UV): K232 , K270 , ΔK Analisi Cromatografiche: Acidi Grassi Ac. Palmitico Ac. Palmitoleico Ac. Eptadecanoico Ac. Eptadecenoico Ac. Stearico Ac. Oleico Steroli Colesterolo Brassicasterolo Campesterolo Stigmasterolo b-Sitosterolo Δ7-Stigmasterolo Ac. Linoleico Ac. Linolenico Ac. Arachidico Ac. Eicosenoico Ac. Behenico Ac. Lignocerico Panel Test

3 VANTAGGI DELLA TECNICA NMR
-metodo non convenzionale- L’errore sperimentale per tutti i composti analizzati è lo stesso. Possiamo ottenere informazioni quantitative riguardo a numerose specie chimiche con un singolo esperimento. Il campione è analizzato direttamente senza estrazioni o altre derivazioni.

4 EFFETTO DELLE ESTRAZIONI
OLIO SENZA ESTRAZIONE OLIO ESTRATTO CON ACETONITRILE

5 EFFETTO DELLE ESTRAZIONI: ZONA DELLE ALDEIDI
OLIO SENZA ESTRAZIONE OLIO ESTRATTO CON ACETONITRILE

6 NMR QUANTITATIVA Per quantificare i componenti presenti nell’olio di oliva è necessario: Un’accurata correzione della linea di base. La normalizzazione dello spettro rispetto ad un’adatta risonanza; in particolare, l’intensità della risonanza a 1,62 ppm dovuta ai CH2 di tutte le catene grasse viene settata a In questo modo tutte le risonanze dello spettro protonico sono normalizzate.

7 NMR QUANTITATIVA: 13C SATELLITI DEI METILI DELLE CATENE DEGLI ACIDI GRASSI
Un esatto ammontare di 13C (1.06%) è sempre presente per ogni dato carbonio. Questo isotopo ha spin ½ e causa uno splitting delle risonanze associate con il protone. Ciò significa che l’ NMR ha la possibiltà di confrontare indirettamente segnali deboli e segnali più intensi usando le 13C satelliti dei segnali più intensi.

8 ARGOMENTI Assegnazione tramite esperimenti 1H e 13C dello spettro dell’olio di oliva (esperimenti 1D e 2D). Risultati della spettroscopia NMR 1H e combinazione con l’analisi statistica. Risultati della spettroscopia NMR 13C e combinazione con l’analisi statistica.

9 TECNICHE NMR PER L’ASSEGNAZIONE
1H-1H COSY (Correlation SpectroscopY). 1H-1H TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY). 1D TOCSY selettivo. 1H-13C Eterocorrelata (HMQC).

10 1H-1H COSY -CH2-CH2-CH2- A B C
L’esperimento COSY correla i protoni con accoppiamenti vicinali e geminali . I protoni con accoppiamento J danno origine ai cross-peaks.

11 1H-1H TOCSY HCO-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3
L’esperimento TOCSY (80 ms) dà la correlazione di tutti i protoni dello stesso sistema di spin.

12 SPETTRO PROTONICO (1H) Strumento: MHz, Bruker AVANCE AQS spectrometer. Preparazione dei campioni: 20 ml di olio di oliva in una miscela di solventi (700 ml CDCl ml DMSO-d6). Durata dell’esperimento: 4 h.

13 SPETTRO PROTONICO DI UN OLIO DI OLIVA: COMPONENTI PRINCIPALI
MHz in CDCl3 e DMSO-d6 T = K

14 SPETTRO PROTONICO DI UN OLIO DI OLIVA: COMPONENTI MINORI

15 ACIDITA’ LIBERA L’acidità libera si misura convenzionalmente tramite una titolazione. Lo spettro 1H di un olio di oliva non ci fornisce una misura diretta dell’acidità libera. E’ possibile tuttavia ottenere una misura indiretta usando le intensità dei digliceridi.

16 DIGLICERIDI OLIO DI OLIVA EXTRAVERGINE OLIO DI OLIVA LAMPANTE

17 ANALISI DEGLI STEROLI Gli steroli si misurano convenzionalmente con le tecniche cromatografiche. Lo spettro NMR 1H mostra nella regione compresa fra 0.60 e 0.70 ppm le risonanze dei CH3-18 degli steroli che possono così essere direttamente analizzati.

18 REGIONE DEI METILI (1H) OLIO DI OLIVA EXTRAVERGINE OLIO DI OLIVA
ACIDO LINOLENICO REGIONE DEI METILI (1H) b SITOSTEROLO OLIO DI OLIVA EXTRAVERGINE OLIO DI OLIVA OLIO DI GIRASOLE OLIO DI MAIS OLIO DI SOIA OLIO DI ARACHIDI

19 REGIONE DEI METILI (1H) OLIO DI OLIVA EXTRAVERGINE OLIO DI OLIVA
A.L.Segre, L.Mannina, Recent Research Developments in Oil Chemistry, (1997), 1, ACIDO LINOLEICO OLIO DI OLIVA EXTRAVERGINE OLIO DI OLIVA OLIO DI GIRASOLE OLIO DI MAIS OLIO DI SOIA OLIO DI ARACHIDI

20 REGIONE DELLE ALDEIDI (1H)
ESANALE ESENALE OLIO DI OLIVA EXTRAVERGINE OLIO DI OLIVA OLIO DI GIRASOLE OLIO DI MAIS OLIO DI SOIA OLIO DI ARACHIDI

21 DETERMINAZIONE DELLO SQUALENE, DEL CICLOARTENOLO E DELLA CLOROFILLA
chlorophyll clorofilla

22 Cattiva separazione dalle acque di vegetazione
ATTRIBUTI SENSORIALI Olio amaro Olio avvinato Cattiva separazione dalle acque di vegetazione Olio pungente Olio fruttato

23 ATTRIBUTI SENSORIALI DELL’OLIO: ZONA DEI - OCH3 FENOLICI
OLIO EXTRAVERGINE ESANOLO OLIO AMARO EXTRAVERGINE

24 ATTRIBUTI SENSORIALI DELL’OLIO: ZONA DEI DOPPI LEGAMI
OLIO EXTRAVERGINE OLIO AMARO

25 ATTRIBUTI SENSORIALI DELL’OLIO: ZONA DEI TERPENI
OLIO EXTRAVERGINE OLIO AMARO EXTRAVERGINE

26 ATTRIBUTI SENSORIALI DELL’OLIO: OLIO AVVINATO
ACETATI

27 ATTRIBUTI SENSORIALI DELL’OLIO: OLIO AVVINATO
EXTRAVERGINE

28 ATTRIBUTI SENSORIALI DELL’OLIO: OLIO RANCIDO
OLIO RANCIDO UMBRO

29 PRODOTTI DI OSSIDAZIONE QUASI ASSENTI IN UN OLIO BUONO
OLIO EXTRAVERGINE OLIO RANCIDO

30 EFFETTO DEL RISCALDAMENTO: ZONA DEI TERPENI
OLIO EXTRAVERGINE OLIO RISCALDATO

31 EFFETTO DEL RISCALDAMENTO: ZONA DELLE ALDEIDI
OLIO EXTRAVERGINE OLIO RISCALDATO

32 EFFETTO DEL RISCALDAMENTO: ZONA DEI FENOLI
OLIO EXTRAVERGINE OLIO RISCALDATO

33 1H NMR + ANALISI STATISTICA
  CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA EEC Promotion of oliviculture Ricerca Sviluppo Tecnologico e alta formazione OLIO DI NOCCIOLA E.U. MEDEO program Hazelnut contamination in olive oil

34 INTENSITA’ DEI SEGNALI NMR IN DIFFERENTI OLI DI OLIVA

35 METODI STATISTICI Analisi della Varianza (ANOVA)
Su tutte le variabili NMR  per selezionare quelle con maggior potere discriminante. Analisi ad albero (TCA) Sulle variabili selezionate tramite l’ANOVA per ottenere una separazione fra i gruppi senza alcuna ipotesi iniziale. Analisi delle Componenti Principali (PCA) Sulle variabili selezionate tramite l’ANOVA per ottenere delle combinazioni lineari di tali variabili che massimizzano la separazione fra gli oggetti (campioni). Analisi discriminante lineare (LDA) Sulle variabili selezionate tramite l’ANOVA per ottenere delle combinazioni lineari di tali variabili che massimizzano la separazione fra I gruppi ipotizzati. Affidabilità del sistema statistico Per provare l’affidabilità del sistema, alcuni campioni di olio, selezionati casualmente, sono stati esclusi dalle analisi e considerati incogniti; se gli oli incogniti sono classificati correttamente nelle analisi successive il sistema statistico può essere considerato stabile e usato per i casi reali.

36 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H)
Olio Siciliano Olio Umbro

37 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H): OLI TOSCANI
Sono stati raccolti campioni da tre aree diverse della Toscana COMUNE ZONA CULTIVAR Seggiano Toscana meridionale Seggianese Arezzo Toscana settentrionale Frantoio Leccino Lucca Scopo del lavoro era quello di valutare l’effetto pedoclimatico congiuntamente all’effetto genetico (cultivar). L. Mannina, M.Patumi, N.Proietti, A.L. Segre, Italian Journal of Food Science. (2001), 13,

38 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H): OLI TOSCANI
TCA LDA Seggiano Lucca Arezzo

39 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H): OLI DEL CENTRO-NORD
LDA L.Mannina, M.Patumi, N.Proietti, D.Bassi, A.L.Segre, Journal of Agriculture and Food Chemistry, (2001), 49,

40 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H): EFFETTO DELL’ANNO
LDA ANNO: 1996; OLI PUGLIESI, LIGURI E SICILIANI

41 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H): EFFETTO DELL’ANNO
LDA ANNO: 1997; OLI PUGLIESI, LIGURI E SICILIANI

42 CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (1H): EFFETTO DELL’ANNO
LDA ANNO: ; OLI PUGLIESI, LIGURI E SICILIANI

43 ADULTERAZIONE DELL’OLIO DI OLIVA: ADDIZIONE DI OLIO DI NOCCIOLA
Dalle nocciole fresche si ottiene un olio la cui composizione è molto simile a quella dell’olio di oliva; si tratta di un olio di elevato pregio ed alto valore commerciale ed in tali condizioni risulta non conveniente addizionare l’olio di nocciola ad un olio di oliva di qualità. Tuttavia il surplus di nocciole vecchie ed ammuffite viene usato per produrre un olio scadente che contiene micotossine cancerogene; quest’olio, opportunamente deodorizzato, viene aggiunto ad oli di oliva scadenti (Turchia , Tunisia) e messo in commercio. Questa è una FRODE di difficile individuazione. L.Mannina, M.Patumi, P.Fiordiponti, M.C.Emanuele, AL.Segre , Italian Food Technology, (2000), 21,

44 ADULTERAZIONE DELL’OLIO DI OLIVA: ADDIZIONE DI OLIO DI NOCCIOLA
AC. LINOLENICO OLIO DI NOCCIOLA OLIO DI OLIVA AC. GRASSI SATURI * OLIO DI NOCCIOLA OLIO DI OLIVA

45 ADULTERAZIONE DELL’OLIO DI OLIVA: ADDIZIONE DI OLIO DI NOCCIOLA
ANALISI DISCRIMINANTE LINEARE

46 SPETTRO DEL CARBONIO (13C)
Preparazione dei campioni: 100 ml di olio di oliva in 600 ml di CHCl3 Durata dell’esperimento: 15 min

47 SPETTRO NMR 13C (150.9 MHz) Palmitico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3 Stearico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3 Oleico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH=CHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3 Linoleico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH2CH2CH2CH3 Linolenico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3 Cis-Vaccenico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH=CHCH2CH2CH2CH2CH2CH3 Eicosenoico O2CCH2CH2CH2 CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH=CHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH3

48 ASSEGNAZIONE DELLO SPETTRO 13C INADEQUATE
(Incredible Natural Abundance DoublE QUAntum Transfer Experiment) -CH2-CH2-CH2- Si ottengono informazioni sui legami 13C-13C A causa della bassa abbondanza del 13C, l’esperimento 2D INADEQUATE ha una sensibilità molto bassa

49 1D SELECTIVE INADEQUATE

50 ADDIZIONE DI COMPONENTI STANDARD
sn 1,3 sn 2 Tri-11-EICOSENOINA OLIO DI OLIVA + Tri-11-EICOSENOINA OLIO DI OLIVA

51 SPETTRO 13C: RISULTATI SPERIMENTALI
CH2- O-CO- R sn 1  CH - O- CO-R’ sn 2  CH2-O- CO-R’’ sn 3 Il chemical shift di ciascun carbonio di una data catena di acido grasso è indipendente dalla natura degli altri due acidi grassi presenti sul glicerolo. Per ciascun acido grasso il chemical shift di alcuni carboni dipende dalla posizione sul glicerolo. Il chemical shift mostra una marcata dipendenza dalla concentrazione.

52 DIPENDANZA DELLE RISONANZE DEI CARBONILI sn 1,3 DALLA CONCENTRAZIONE DELL’OLIO
▲ eicosenoico ▼ saturi ▬ linoleico ● oleico d=d0 + d1X + d2X2 L.Mannina, C.Luchinat, M.Patumi, M.C.Emanuele, E.Rossi. A.L.Segre, "Concentration dependence of 13C NMR spectra of triglycerides: implications for the NMR anlysisis of olive oils", Magnetic Resonance in Chemistry (2000), 38,  

53 SPETTRO 13C DI UN OLIO DI OLIVA

54 REGIONE DEI CARBONILI (13C)
CH2- O-CO- R sn 1  CH - O- CO-R’ sn 2  CH2-O- CO-R’’ sn 3 REGIONE DEI CARBONILI (13C)

55 ADULTERAZIONI CON OLI DI SEMI
REGIONE DEI CARBONILI (13C) OLIO DI NOCCIOLA OLIO DI ARACHIDI OLIO DI SOIA OLIO DI OLIVA

56 13C NMR + ANALISI STATISTICA
  CARATTERIZZAZIONE GEOGRAFICA (EFFETTO PEDOCLIMATICO) CARATTERIZZAZIONE GENETICA (EFFETTO DELLA CULTIVAR)

57 EFFETTO PEDOCLIMATICO SULLA COMPOSIZIONE DEGLI OLI DI OLIVA ARGENTINI ED ITALIANI: UN PROBLEMA AGRONOMICO La Catamarca è una regione semidesertica dell’Argentina caratterizzata da un clima con forti escursioni termiche e da una vegetazione con prevalenza di erbacee e arbusti. Scopo del lavoro era quello di riqualificare tale zona con l’impianto di olivi (Olea europea L.) e più precisamente con cultivar in grado di dare oli con caratteristiche simili a quelle richieste dalla Comunità Europea. Sono state quindi realizzate due piantagioni sperimentali, una in Argentina ed una in Italia, nelle quali sono state impiantate delle cultivar tipiche del bacino mediterraneo. L.Mannina, G.Fontanazza, M.Patumi, G.Ansanelli, A.L.Segre, Grasa y Aceites, (2001), 52,

58 EFFETTO PEDOCLIMATICO (13C)
CULTIVAR TCA Argentina (Catamarca) Biancolilla (Sicilia) Cerasuola (Sicilia) Coratina (Puglia) Kalamata (Puglia) Peranzana (Puglia) Leccino (Lazio) I-77 (Umbria) Frantoio (Lazio) Arbequina

59 EFFETTO PEDOCLIMATICO (13C)

60 CARATTERIZZAZIONE GENETICA DELLE CULTIVAR SICILIANE (13C)
Lo scopo era quello di selezionare delle variabili in grado di separare (individuare) quattro diverse cultivar della Sicilia. Partendo da circa 70 variabili ottenute dallo spettro 13C è stata applicata un’analisi della varianza (ANOVA) con la quale sono state selezionate circa 30 variabili con elevato potere discriminante fra le cultivar. E’ interessante notare che tali variabili sono relative solo agli acidi grassi legati al glicerolo in posizione 1,3. L.Mannina, G.Dugo, F.Salvo, L.Cicero, G.Ansanelli, C.Calcagni, A.L. Segre, Journal of Agriculture and Food Chemistry, (2003), 51,

61 CARATTERIZZAZIONE GENETICA (13C)

62 PUBBLICAZIONI 1H NMR Origine geografica degli oli di oliva.
Qualità ed autenticazione degli oli di oliva. L.Mannina, C.Calcagni, E.Rossi, A.L. Segre, Annali di Chimica, 2003, 93, L.Mannina, AL Segre, Grasa y Aceites, 2002, 53, L.Mannina, G.Fontanazza, M.Patumi, G.Ansanelli, A.L.Segre, Grasa y Aceites, (2001), 52, L.Mannina, M.Patumi, N.Proietti, D.Bassi, A.L.Segre,, Journal of Agriculture and Food Chemistry, (2001), 49, L.Mannina, M.Patumi, N.Proietti, A.L. Segre, Italian Journal of Food Science. (2001), 13, L.Mannina, M.Patumi, P.Fiordiponti, M.C.Emanuele, AL.Segre “Olive and hazelnut oils: a study by high-field 1H NMR and gas chromatography, Italian Food Technology, (2000), 21, L.Mannina, P.Barone, M.Patumi, P.Fiordiponti, M.C.Emanuele, A.L.Segre, Recent Research Developments in Oil Chemistry, (1999), 3, M.C.Emanuele, L.Mannina, M.Patumi, A.L.Segre, "Studio sulla sofisticazione dell'olio di oliva con olio di nocciola", OLIVO & OLIO, (1999), 11, L.Mannina, M.Patumi, P.Fiordiponti, M.C.Emanuele, A.L.Segre,Italian Journal of Food Scienc., (1999), 11, M.C.Emanuele, L.Mannina, M.Patumi, A.L.Segre OLIVO & OLIO (1998), 2/3, R.Sacchi, L.Mannina, P.Fiordiponti, P.Barone, L.Paolillo, M.Patumi, A.L.Segre Journal of Agricultural and Food Chemistry, (1998), 46, A.L.Segre, L.Mannina, "1H-NMR Study of Edible Oils", Recent Research Developments in Oil Chemistry, (1997), 1, R.Sacchi, M.Patumi, G.Fontanazza, P.Barone, P.Fiordiponti, L.Mannina, E.Rossi, A.L.Segre, Journal of the American Oil Chemist’s Society (1996), 73,

63 PUBBLICAZIONI 13C NMR e 13C NMR-GC
Distribuzione posizionale degli acidi grassi sul glicerolo negli oli vegetali. Effetto delle condizioni pedoclimatiche sulla composizione dell’olio di oliva . L.Mannina, G.Dugo, F.Salvo, L.Cicero, G.Ansanelli, C.Calcagni, A.L. Segre, “ Study of the Cultivar-Composition Relationship in Sicilian olive Oils by GC, NMR, and Statistical Methods”, Journal of Agriculture and Food Chemistry, (2003), 51, L.Mannina, G.Fontanazza, M.Patumi, G.Ansanelli, A.L.Segre, “Italian and Argentine olive oils: a NMR and gas chromatographic study”, Grasas y Aceites, L.Mannina, C.Luchinat, M.C.Emanuele, A.L.Segre, "Acyl positional distribution of glycerol tri-esters in vegetable oils: a 13C NMR study", Chemistry and Physics of Lipids, (1999), 103,   L.Mannina, C.Luchinat, M.Patumi, M.C.Emanuele, E.Rossi. A.L.Segre, "Concentration dependence of 13C NMR spectra of triglycerides: implications for the NMR anlysisis of olive oils", Magnetic Resonance in Chemistry (2000), 38,  

64 RINGRAZIAMENTI: Dr.Annalaura Segre, Dr.Donatella Capitani, Dr.Stéphane Viel, Dr. Noemi Proietti, Sig. Enrico Rossi (CNR, Ist. Metodologie Chimiche, Roma ) Dr. Giuliana Ansanelli (ENEA, Trisaia) Prof. Claudio Luchinat (Università di Firenze) Dr. Fontanazza, Dr.Maurizio Patumi (CNR, Ist.Ricerche Olivicoltura, Roma ) Prof. Giacomo Dugo (Università di Messina) Dr. M.Carmela Emanuele (Farchioni Oli)