Che cosa sono le biotecnologie Come è noto, la tecnologia si sviluppa parallelamente alla scienza, rappresentandone alcune volte lo strumento per renderne possibile l'avanzamento (ad esempio quando si costruisce un telescopio), altre volte il naturale sbocco applicativo (come quando si costruisce un by- pass). Le biotecnologie sono un insieme di tecniche sviluppate a partire dalle conoscenze scientifiche acquisite nel campo della biologia e della genetica, finalizzate alla produzione di nuove molecole a partire da sistemi biologici esistenti in natura ed opportunamente selezionati o appositamente creati in laboratorio.

Le biotecnologie sono tutte quelle tecnologie che usano organismi viventi, o parti di essi allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili all'uomo, di migliorare piante ed animali o sviluppare microrganismi utili per usi specifici Le biotecnologie TRADIZIONALIINNOVATIVE Sulla base dei metodi impiegati per la realizzazione dei prodotti possiamo distinguere

Le biotecnologie microbiche possono essere definite come l'uso di organismi viventi, di loro componenti o prodotti per ottenere beni e servizi. Queste biotecnologie, che sono denominate "classiche" in contrapposizione alle biotecnologie "innovative" dei nostri giorni, constano essenzialmente di processi fermentativi. Biotecnologie

BIOTECNOLOGIA Tecnica consistente nell'utilizzo di organismi viventi o loro derivati allo scopo di produrre quantità commerciali di prodotti utili, o per migliorare le caratteristiche di piante ed animali Ingegneria genetica (innovative): Insieme di tecniche che consentono di modificare il patrimonio genetico di organismi in modo da trasferire da un essere vivente ad un altro caratteristiche utili

INTRODUZIONE ALLE BIOTECNOLOGIE RICOMBINANTI

Il clonaggio molecolare Nell’accezione più comune un “clone” è una copia esatta di qualcosa e “clonare” significa riprodurre esattamente qualcosa. Per esempio si clonano i numeri dei cellulari o i DVD. In termini biologici con il termine clonaggio si intende la riproduzione di organismi geneticamente uguali mediante la mitosi, o riproduzione asessuale. Per esempio la riproduzione dei batteri è di tipo clonale. Naturalmente sebbene tutti i cloni siano geneticamente uguali, non sono sempre fenotipicamente uguali, a causa dell’influenza di fattori di tipo epigenetico. Per es. considerate il caso dei gemelli omozigoti.

Sebbene animali e piante normalmente si riproducono per meiosi, è possibile clonare organismi superiori e, in effetti, il clonaggio di organismi è oggetto di intenso studio e fonte di acceso dibattito. E’ importante sottolineare la differenza tra il clonaggio (o clonazione) di organismi superiori e il clonaggio molecolare. Nel primo caso, come quello, per esempio della pecora Dolly, per quanto tecnicamente complesso, si arriva alla creazione di individui geneticamente uguali senza prevedere alcuna modifica genetica. Nel secondo caso, invece, come nel caso del mais trasgenico per esempio, i geni ven gono manipolati ed introdotti in organismi ospiti, arrivando infine alla creazione di organismi geneticamente modificati (OGM). Questi organismi non necessariamente hanno geni modificati; molto spesso contengono semplicemente nuove combinazioni geniche, introducendo, per esempio, un gene vegetale utile, in una specie vegetale che ne è sprovvista. Il clonaggio molecolare, effettuato con tecniche di ingegneria genetica, consiste nel creare, modificare o trasferire geni, inserirli in vettori di replicazione ed introdurli in un organismo che provvederà a produrne copie esatte.

Definizione di biotecnologie ricombinanti Il termine “biotecnologie ricombinanti” comprende e definisce tutte quelle tecnologie centrate sulla manipolazione del materiale genetico per la realizzazione di nuove combinanzioni di caratteri e che includono numerose tecniche applicate allo studio e alla diagnostica a livello molecolare Questa definizione è un sinonimo di “Ingegneria genetica”,

Nascita e sviluppo dell’ingegneria genetica 1928 Dimostrazione che il DNA può trasformare geneticamente (Griffith) 1944 Si dimostra che l'informazione genetica è contenuta nel DNA (Avery) 1953 Si pubblica la struttura del DNA (Watson e Crick ) 1966 Decifrazione del codice genetico 1970 Isolamento dei primi enzimi di restrizione 1972 Sintesi chimica di un gene (Khorana) 1973 Primi clonaggi in batteri (Boyer e Cohen) 1976 Metodo di sequenziamento del DNA (Maxam e Gilbert) 1978 Si commercializza la prima insulina umana 1980 Si brevettano in USA i primi organismi ricombinanti 1983 Si ottengono le prime piante transgeniche 1988 Viene pubblicato il metodo della PCR (Mullis) 1990 Si inizia la sperimentazione sull'uomo della terapia genica 1996 Viene completata la prima sequenza di un genoma eucariotico 1997 Viene clonata una pecora (Dolly) da un nucleo di cellula differenziata 2001 Viene pubblicata la sequenza del genoma umano 1976 Conferenza di Asilomar sulle ricadute delle tecniche del DNA ricombinante

Stabilito che ci occuperemo di manipolazione genica il primo passo consiste nell’ identificare isolare ed amplificare il DNA oggetto del nostro studio, introducendolo in un organismo dove possa replicarsi indefinitivamente; in altre parole dobbiamo clonarlo. Qui sotto è riportato lo schema generale di clonaggio molecolare che si effettua in batteri per isolare ed amplificare un frammento di DNA. Isolamento di un gene Identificazione di un gene Inserimento in un vettore Introduzione in un ospite per amplificare il gene Selezione della sequenza genica

GLI ENZIMI DI RESTRIZIONE  Sono enzimi che tagliano la doppia elica del DNA in corrispondenza di specifiche sequenze. Per questo motivo vengono anche detti endonucleasi di restrizione (invece le esonucleasi distruggono il DNA partendo dalle estremità).  Ne esistono molti tipi diversi, ognuno dei quali riconosce una sequenza particolare.

VETTORI Sistemi utilizzati per inserire un certo costrutto genico in particolari tipi di cellule, superando le barriere di specie imposte dai normali processi riproduttivi. I possibili vettori sono 2 (i piu’ importanti): 1. Plasmidi; 2. Virus fagi;

VETTORI: PLASMIDI  Molecole extra-cromosomali di DNA circolare capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale batterico. Presenti in natura (batteri, lieviti, alcuni eucarioti superiori) in stato di relazione parassitica o simbiontica verso la cellula ospite.  portatori di geni che arrecano un vantaggio selettivo alla cellula ospite (es. resistenza a un antibiotico)  Possono ospitare DNA estraneo (con limiti di grandezza)  Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale del batterio.

Caratteristiche essenziali dei vettori plasmidici: 1)Origine di replicazione in E. Coli 2) Marcatore di selezione che permette ai batteri trasformati di crescere su terreno selettivo

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

I Plasmidi Sono degli utili vettori in quanto si moltiplicano rapidamente e sono facilmente inglobati dai batteri attraverso la membrana cellulare. Sono però vettori affidabili solo per segmenti lunghi fino a 4000 coppie di basi azotate, infatti tollerano solo brevi sequenze di DNA estraneo, mentre i segmenti lunghi tendono ad essere eliminati col passare delle generazioni I Virus fagi Anche i virus possono fungere da vettori che spostano pezzi di DNA da una cellula ad un’altra. Infatti il DNA dei fagi temperati può integrarsi nei siti specifici del cromosoma ospite e duplicarsi con il cromosoma stesso. I virus utilizzati sono modificati in modo tale da non essere più patogeni, ma da poter ancora trasmettere informazione genetica.

Il fago lambda come vettore di clonaggio

VIRUS FAGI

CLONAGGIO: -PREPARAZIONE DI VETTORE E INSERTO - LIGASI - TRASFORMAZIONE - SELEZIONE - CRESCITA COLONIE

IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

Resistenza agli antibiotici: Solo i batteri che hanno integrato un plasmide codificante il gene per la resistenza possono crescere su agar nutritivo in presenza di antibiotico

La tecnologia del Dna ricombinante è uno strumento potente di analisi della struttura e della regolazione dei geni. Inoltre, permette di aggirare gli ostacoli che si frappongono alla totale libertà di scambio e mescolamento dei geni, permettendo la combinazione di geni provenienti da specie molto distanti tra loro. In modo molto schematico, per isolare e clonare un gene di interesse è necessario tagliare il cromosoma in frammenti utilizzando un adatto enzima di restrizione con taglio "sfasato". I frammenti ottenuti vengono mescolati con il Dna di un plasmide vettore che presenti le stesse "estremità appiccicose". Si ottengono così tanti piccoli anelli di Dna formati dal frammento con il gene di interesse e il plasmide legati insieme dalla Dna ligasi, l'enzima capace di "legare" fra loro frammenti di Dna. La molecola di Dna ricombinante così ottenuta viene introdotta all'interno di un batterio ospite, il quale moltiplicandosi produce grandi quantità del prodotto codificato dal gene inserito.

1.Il DNA viene tagliato tramite specifici enzimi di restrizione 2.Il plasmidio viene tagliato con gli stessi enzimi 3.Il plasmide viene aperto 4.Il DNA, portatore del gene isolato, vine incollato al plasmidio tramite un specifico enzima detto DNA ligasi 5. Si forma un plasmidio transgenico con la resistenza all'antibiotico datagli dal gene estraneo

1.Gene identified and cloned 2.Gene inserted into harmless virus carrier 3.T cells taken from patient’s blood 4.T cells grown in lab, then infected with virus 5.T cells start producing life-saving enzyme 6.T cells infused back into patient Future targets Hemophilia Cancer Cystic fibrosis Tay-Sachs disease Gaucher disease Duchenne muscular dystrophy Phenylketonuria Sickle cell anemia Parkinson’s disease Diabetes Familial cholesterol disorders Alzheimer’s disease Polycystic kidney disease Early onset breast cancer Progressive myoclonic epilepsy Terapia Genica

IL MAIS Il più noto alimento transgenico è il mais bt, molto più produttivo rispetto al fratello "naturale", grazie alla capacità di uccidere le larve di lepidotteri e di resistere agli erbicidi.

rischi di variazione rischio di creazione (di organismi nuovi e potenzialmente pericolosi) L’inquinamento genetico produce nuovi microrganismi che possono migrare e riprodursi e cambiare a loro volta, rendendo praticamente impossibile il controllo e la reversibilità di processi di mutazione su base genetica. Il rischio e le biotecnologie

Esistono barriere naturali che impediscono la casuale mescolanza dei geni limitando il numero di combinazioni possibili tra gli individui che appartengono a una specie. In un certo senso, non c’è nulla di nuovo nell’ingegneria genetica: sono diverse migliaia d’anni che gli agricoltori(innesto) cercano di migliorare le razze di animali e le varietà di piante per ottenere caratteristiche più interessanti Il punto sulla ricerca

Oltre ad accelerare i programmi di ibridazione e a migliorare le probabilità di successo, la tecnologia genetica é in grado di combinare materiale genetico in modi che in natura non sarebbero spontaneamente possibili. Per esempio copie di geni animali possono essere introdotti nelle piante e copie di geni vegetali possono essere inseriti nei batteri. E' proprio questa potenzialità a sollevare quelle preoccupazioni in merito all'etica e alla sicurezza,

Il mais dell Ciba-Geigy contiene il gene per una tossina chiamata Bt (perchè ricavata da Bacillus thuringiensis), che rende i tessuti della pianta capaci di sintetizzare la glicoproteina selettivamente tossica per gli insetti dannosi, ma innocua per tutti gli altri animali e per l'uomo. Purtroppo nella costruzione di tali piante transgeniche è stato usato come marcatore un gene per la resistenza all'ampicillina, uno dei principali antibiotici sia nella medicina umana che in veterinaria. Non è ancora stata esclusa la possibilità che tale gene si trasferisca alla flora batterica degli animali nutriti con mangime a base di mais geneticamente modificato, incrementando la già deplorata diffusione di ceppi batterici resistenti agli antibiotici

L’ingegneria genetica, a differenza della biotecnologia più tradizionale, non prevede un rimescolamento totale, ma solo l’inserimento di un gene, o di un gruppo ristretto di geni, nel Dna di un’altra cellula. La nuova proteina per es. può interferire con quelle prodotte dall’animale: una volta che il gene è inserito in un patrimonio genetico, si può trasmettere ad altri, favorendo in seguito nuove combinazioni. Le regole della ricerca

Un settore su cui si concentra l’interesse dei ricercatori è la produzione di animali resistenti alle infezioni, allo scopo di ridurre l’impiego di antibiotici negli allevamenti. La complessità degli animali superiori rende la manipolazione genetica molto più difficile, e quindi più costosa, di quella relativa ai vegetali.

Dal latte di capra si ricava l’attivatore tissutale del plasminogeno, che scioglie i coaguli del sangue e che viene quindi somministrato agli infartuati. Dal latte di alcuni conigli transgenici viene estratta l’interleuchina-2, una proteina umana implicata nella regolazione del sistema immunitario che viene somministrata ai malati di cancro