Funzione, struttura e replicazione del DNA

Frederick Griffith (1928) – “principio trasformante”

Oswal Avery, Colin MacLeod, Maclyn MacCarty (1944) Il “principio trasformante” è il DNA

Alfred Hershey Marta Chase (1952) 35S marcatore delle proteine 32P marcatore del DNA La replicazione del fago all’interno del batterio è associata alla frazione contenente 32P, ovvero al DNA.

Il DNA (Acido DesossiriboNucleico) è costituito da nucleotidi (base azotata + zucchero + fosfato)

La regola di Chargaff: la quantità di A è uguale alla quantità di T la quantità di G è uguale alla quantità di C la quantità di G+A è uguale alla quantità di C+T

James D. Watson and Francis Crick

Rosalind Franklin

Rosalind Franklin 1952

Struttura errata a tripla elica proposta da Pauling nel 1952

Accoppiamento di basi proposto da Watson e Crick G-C

Elementi chiave della struttura del DNA Elica a doppio filamento con diametro uniforme Elica destrorsa I due filamenti sono antiparalleli Le basi sono all’interno dell’elica, perpendicolari all’asse dell’elica e formano coppie di basi complementari

Accoppiamenti complementari delle basi del DNA L’adenina si lega alla timina con 2 legami idrogeno. La citosina si lega alla guanina con 3 legami idrogeno. Ogni coppia di basi è costituita da una purina e una pirimidina.

Watson, Crick, and Wilkins were awarded the 1962 Nobel Prize in Physiology or Medicine "for their discoveries concerning the molecular structure of nucleic acids and its significance for information transfer in living material”.

“It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material.”

La sintesi di un filamento di DNA richiede un innesco ad RNA ed avviene sempre in direzione 5’->3’

I due filamenti figli si formano in modo diverso: continuo (“veloce”) discontinuo (“lento”)

La sintesi del filamento “lento” richiede l’intervento di un altra DNA polimerasi e di una DNA ligasi

Accorciamento dei telomeri e telomerasi Le estremità dei cromosomi si accorciano ad ogni replicazione. Questo stabilisce un limite naturale alla replicazione e alla vita di alcune cellule. In alcune cellule però è presente un enzima chiamato Telomerasi che ripristina le porzioni di telemeri mancanti utilizzando un filamento di RNA come stampo. Il 90% delle cellule tumorali esprime la telomerasi. Questa proteina è quindi bersaglio di alcuni farmaci tumorali Telomeri nell’uomo: TTAGGG * 2500

Sistemi di correzione e riparo del DNA Correzione di bozze (“proofreading”) – durante la replicazione la DNA polimerasi può eliminare una base incorretta attraverso l’attività 3’-5’ fosfodiesterasica Riparo dei misappaiamenti – le coppie di basi non corrette sul filamento nuovo vengono riparate da un complesso proteico che segue la polimerasi in duplicazione. La metilazione del DNA consente di distinguere il filamento vecchio dal nuovo. Riparo per escissione – le basi modificate da agenti chimici successivamente alla replicazione del DNA vengono riconosciute e riparate.

Meccanismi di correzione e riparo nel DNA CH3

Reazione a catena della polimerasi (PCR)

Taq polimerasi da Thermus acquaticus

Sanger. 1975 ...TTTCGGACC CCGG… Sanger determined the complete amino acid sequence of insulin in 1955. In doing so, he proved that proteins have specific structures. He began by degrading insulin into short fragments by mixing the trypsin enzyme (which splits protein) with an insulin solution. He then applied a spot of the mixture to a sheet of filter paper. He passed a solvent through the filter paper in one direction, and passed an electric current through the paper in the opposite direction. Depending on their solubility and electric charge, the different fragments of insulin moved to different positions on the paper, creating a distinct pattern. Sanger called these patterns “fingerprints”. Like human fingerprints, these patterns were characteristic for each protein, simple and reproducible. He reassembled the short fragments into longer sequences to deduce the complete structure of insulin. Sanger concluded that the protein insulin had a precise amino acid sequence. It was this achievement that earned him his first Nobel prize in Chemistry in 1958. In 1975, he developed the chain termination method of DNA sequencing, also known as the Dideoxy termination method or the Sanger method[1]. Two years later he used his technique to successfully sequence the genome of the Phage Φ-X174; the first fully sequenced DNA-based genome. He did this by hand, without any automation. This has been of key importance in such projects as the Human Genome Project and earned him his second Nobel prize in Chemistry in 1980, together with Walter Gilbert.

Pyrosequencing

Whitehead sequencing center