- Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica per il DNA UN PO’ DI STORIA... 1900 - Riscoperta delle leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri, che Mendel aveva pubblicato nel 1865 e che avevano come assunto l'esistenza di fattori discreti, elementen, i geni, che determinano i caratteri e che si trasmettono da una generazione all'altra. 1902 - Sutton ipotizza che i fattori mendeliani, i geni, siano localizzati sui cromosomi. 1910-1911 - Morgan inizia a mappare i geni sui cromosomi del moscerino della frutta D.Melanogaster 1944 - Avery MacLeod e McCarty stabiliscono che il DNA è il materiale ereditario. 1953 - Watson e Crick propongono la struttura a doppia elica per il DNA 1956 - Viene stabilito che il patrimonio cromosomico completo dell'uomo è di 46 cromosomi. 1961-1966 - Viene decifrato il codice genetico, ovvero stabilito il rapporto tra le 64 triplette possibili a partire dalle 4 basi nucleotidiche del DNA, e i 20 aminoacidi che formano le proteine.

1967 - Mary Weiss e Green introducono la tecnica dell'ibridazione delle cellule somatiche che rende più agevole la mappatura dei geni umani. 1972 - Berg costruisce la prima molecola DNA ricombinante in vitro utilizzando gli enzimi di restrizione. Vengono realizzati con successo i primi esperimenti di clonazione del DNA. 1973 - Cohen, Chang e Boyer costruiscono il primo batterio ricombinante. Si tiene la prima conferenza sulla mappatura dei geni umani. 1974 - Cohen e Boyer ottengono l'espressione di un gene estraneo trapiantato in un batterio con la tecnica del DNA ricombinante. 1975 - Si tiene la conferenza di Asilomar che propone una moratoria sugli esperimenti con il DNA ricombinante in assenza di linee guida per la sicurezza delle manipolazioni genetiche. 1977 - Per la prima volta un gene umano viene ricombinato e inserito in un batterio per clonare una proteina, la somatostatina Sanger, già premio Nobel come inventore del metodo per sequenziare le proteine, sviluppa un metodo nuovo ed efficiente per sequenziare il DNA (contemporaneamente Gilbert e Maxam inventano un metodo analogo).

1978 - Boyer costruisce una versione sintetica del gene dell'insulina e lo inserisce in un batterio. La Genentech, fondata nel 1976 dallo stesso Boyer insieme a Swanson, otterrà il permesso di commercializzare l'insulina prodotta per ingegneria genetica nel 1982 e quindi il brevetto 1978-1980 - Vengono sviluppate nuove tecniche basate sull'ibridazione molecolare e l'utilizzazione come marcatori delle variazioni individuali del DNA per mappare fisicamente i geni e le sequenze geniche sui cromosomi. Grazie alle nuove tecniche e alla collaborazione internazionale tra i mappatori, i geni mappati passano da 579 nel 1981 a 1.879 nel 1991: tra questi vengono mappati il gene della corea di Huntington (1983), il gene per la distrofia muscolare (1987) e il gene per la fibrosi cistica (1989). 1980 - Viene concesso il primo brevetto su una forma di vita geneticamente modificata, un microrganismo che si nutre di petrolio. Mullis inventa la tecnica della PCR. 1981 - Viene prodotto il primo animale transgenico. 1983 - Viene inventato il primo sequenziatore automatico. 1989 - Viene creato il National Center for Human Genome Research (NCHGR), guidato da James Watson per mappare e sequenziare tutto il DNA umano entro il 2005

- Craig Venter crea l'Institute for Genomics Research. 1992 - Craig Venter crea l'Institute for Genomics Research. 1993 - Francis Collins assume la direzione del National Human Genome Research Institute (ex NCHGR). 1995 - Viene pubblicata la prima sequenza completa del genoma di un organismo vivente diverso da un virus, il batterio Haemophilus influenzae. 1996 - Viene riportato il sequenziamento completo del primo organismo complesso, il lievito Saccharomyces cerevisiae. 1997 - Viene costruito il primo cromosoma umano artificiale e annunciata la clonazione di un mammifero, Dolly . 1986 - Viene proposto da diversi biologi molecolari, tra cui Renato Dulbecco, di sequenziare completamente il genoma umano. 1988 - Viene concesso il brevetto per un topo transgenico altamente suscettibile al tumore del seno.

1998 - Viene pubblicata una prima bozza della mappa del genoma umano, che mostra la localizzazione di più di 30.000 geni. Viene pubblicata la sequenza completa del primo genoma di un animale, il verme Caenorhabditis elegans. Venter e la Perkin Elmer Corporation fondano la Celera Genomics con l'intento di sequenziare tutto il genoma umano in tre anni con il metodo del whole genome shotgun. 2000 - Viene pubblicata la sequenza completa del genoma di Drosophila melanogaster e viene annunciato dalla Celera Genomics il sequenziamento di tutte le basi nucleotidiche del DNA umano con il metodo whole genome shotgun.

Date storiche della sequenza del DNA 1869 1944 1953 1965 1970 1977 Miescher osserva per la prima volta il DNA 1944 Avery propone il DNA come materiale genetico 1953 Watson e Crick determinano la struttura della doppia elica 1965 Holley sequenza il tRNA di lievito 1970 Vengono sviluppate le tecniche per la sintesi degli oligonucleotidi e per la degradazione chimica del DNA. Viene introdotta l’elettroforesi su gel per la Separazione di frammenti di DNA 1977 METODO SANGER (terminazione di catena) METODO MAXAM-GILBERT (degradazione chimica) 1980 Il DNA genomico viene clonato nel fago M13 o in vettori plasmidici, nascono i primi programmi informatici di analisi dei dati, vengono sviluppate nuove tecnologie per il sequenziamento 1986 KARY MULLIS Introduce la PCR 1989 AUTOMAZIONE PARZIALE Vengono sviluppate le prime apparecchiature per il sequenziamento che impiegano sistemi per la rilevazione della fluorescenza. 2000 Automazione completa Sequenziamento completo del genoma umano

Sequenziamento Estrazione di DNA o RNA PCR o amplificazione mediante clonaggio Purificazione del campione di DNA Cycle Sequencing Precipitazione dei prodotti di cycle sequencing Sequenziamento automatico Analisi dei dati

Sequenziamento del DNA Metodi tradizionali ed odierni

Metodi di Maxam-Gilbert e di Sanger Hanno in comune la generazione di una scaletta di frammenti di DNA A singolo filamento, ciascuno più lungo del precedente di una base. Frammenti di dimensioni crescenti possono essere separati mediante Corsa elettroforetica su gel di poliacrilammide. A corsa ultimata il gel viene posto a contatto con una pellicola radiorafica Sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande. L’immagine ottenuta, letta di seguito darà la sequenza delle basi.

Il metodo Maxam-Gilbert (o metodo di sequenziamento a degradazione chimica) Questo metodo, basato sulla degradazione chimica di frammenti di DNA a doppio filamento, è ormai poco utilizzato, perché non adatto al sequenziamento automatico e perché utilizza composti chimici dannosi alla salute Si differenzia da tutti gli altri metodi perché non utilizza sintesi enzimatiche ma trattamenti chimici che agiscono a livello di singoli nucleotidi. I frammenti di DNA a doppio filamento possono essere generati per frammentazione o digestione enzimatica. In entrambi i casi le molecole a doppio filamento devono essere convertite in molecole a singolo filamento e marcate terminalmente

Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento Denaturazione e separazione dei due filamenti Il DNA a singola elica viene suddiviso in quattro campioni, ognuno dei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una o due delle 4 basi del DNA. G = DMS + piperidina G + A = DMS + piperidina + acido formico C + T = idrazina + piperidina C = idrazina + piperidina in NaCl 1,5 M Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazione parziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradate producendo una serie di frammenti la cui lunghezza dipenderà dalla distanza tra l’estremità marcata e il sito di taglio Separazione dei frammenti marcati mediante gel elettroforesi e Visualizzazione dei risultati mediante autoradiografia

Il metodo Maxam-Gilbert

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Il sequenziamento a terminazione di catena coinvolge la sintesi di nuovi filamenti di DNA, complementari ad uno stampo a singolo filamento Per la sintesi del DNA si utilizzano DNA polimerasi caratterizzate da Elevata processività Bassa attività esonucleasica 5’-3’ Bassa attività esonucleasica 3’-5’ (es. Klenow, Sequenasi)

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad Uno stampo a singola elica ha bisogno di: un innesco specifico (primer) La marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S

Sintesi del filamento marcato PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A G T A C C 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’

(o metodo a terminazione di catena) Il metodo Sanger (o metodo a terminazione di catena) Nel sequenziamento a terminazione di catena la reazione oltre ad uno stampo a singola elica un innesco specifico (primer) la marcatura con un dNTP* marcato, di solito con 35S ha bisogno di: una miscela di ddNTP, uno per ogni reazione di sequenza

Terminazione della catena La sintesi del filamento complementare, tuttavia non prosegue indefinitamente, perché la miscela di reazione contiene, in quattro distinte reazioni piccole quantità di specifici dideossi nucleotidi trifosfati, ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP, che bloccano l’allungamento perché posseggono un solo atomo di idrogeno al posto del gruppo -OH in 3’

Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno PRIMER DNA Polimerasi 5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ + ddNTP ( per es. ddCTP) STOP 5’-A T C T T T T A G A G T A C C T G A G*A G A T G A T A G*A T G T AddC 3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’ Il risultato è una serie di frammenti interrotti ciascuno in corrispondenza di ogni dCTP ddCTP ddCTP ddCTP ddCTP ddCTP ddCTP

Schema di sequenziamento a terminazione di catena DNA stampo a singola elica 3’-GGCTAAC Ibridazione con Il primer 5’ 3’ 3’-GGCTAAC + [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTTP(dNTP)+Sequenasi ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP -CCG ddA -ddC -CC ddG -CCGA ddT -C ddC -CCGATT ddG -CCGAT ddT A C G T -CCGATT ddG -CCGAT ddT -CCGA ddT -CCG ddA -CC ddG -C ddC -ddC G T T A G C C Direzione di lettura Sequenza: 5’-CCGATTG

Marcatura Radioattiva Sequenziamento manuale Pratica ormai superata dal seq. automatico Marcatura Radioattiva Primer marcati con 32P oppure 35S dNTP Colorazione Silver Staining Evidenzia direttamente su gel le bande senza ulteriori modificazioni, attraverso la precipitazione di Ag

Nuovi metodi di sequenziamento Il sequenziamento a ciclo termico ( PCR asimmetrica) Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Il pirosequenziamento

Sequenziamento automatico 1 Colorante - 4 Corsie Per ogni campione si eseguono 4 reazioni di estensione separate (una per ogni ddNTP) utilizzando un unico colorante L’uso di 4 corsie aumenta però la variabilità di corsa

Sequenziamento automatico 4 Coloranti - 1 Corsia Unica reazione ed unica corsa; Ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione: ddATP ddTTP ddGTP ddCTP Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa

Il sequenziamento automatizzato con marcatori fluorescenti Coniugando a ciascun ddNTP un diverso marcatore fluorescente, è possibile effettuare le quattro reazioni di sequenziamento in un unico tubo da saggio e caricare il tutto in un solo pozzetto di gel ddA ddT ddC ddG

Metodi di Marcatura Sequenziamento automatico Marcatura dei Primers primers progettati con “tag” colorati a: Fluorescenza UV Fluorescenza IR minore Background maggiore Sensibilità Marcatura dei Terminatori ddNTPs marcati con fluorofori o differenti coloranti

Terminatori BigDye A D Sequenziamento automatico Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker Vantaggi: Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità maggiore, facilità interpretativa per A e G attigue D A

Dalla cycle sequencing all’elettroforetogramma...

Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e le informazioni vengono integrate e trasformate in picchi di colore diverso, con aree proporzionali all’intensità di emissione.

Sequenziamento automatico Prevede l’utilizzo di marcatura a fluorescenza rilevata automaticamente da un laser Sequenziatori a Gel reazione e caricamento dei campioni sono eseguite manualmente Esistono kits in commercio che permettono di velocizzare e standardizzare tali operazioni fornendo mix di reazione, soluzioni di poliacrilammide a cui aggiungere soltanto Temed o gel preformati

Gel per elettroforesi “slab” gel di poliacrilammide (dal 4% al 6%) molto sottili in condizioni denaturanti (Urea) Apparati verticali di lunghezza variabile a seconda del numero di basi da leggere (22 cm-1 m) Il forte campo elettrico a cui vengono sottoposti produce elevato calore che deve essere dissipato con piastre di alluminio o ventole

Sequenziatori Capillari Sequenziamento automatico Sequenziatori Capillari l’intervento dell’operatore è minimo il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa esegue la separazione elettroforetica i frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che corrono lungo il capillare

Sequenziatori Capillari Sequenziamento automatico Sequenziatori Capillari 1 Capillare 16 Capillari 96 Capillari (Scala di Produzione) Richiede campioni privi di: sali, molecole cariche negativamente, proteine, detergenti e templates non marcati

Sistemi di Rilevamento Sequenziamento automatico Sistemi di Rilevamento Camera CCD ( Charge - Coupled Device) Altissima risoluzioneImmagine Elettroferogramma Sequenza in pochi minuti Assenza di Filtri Uso di qualsiasi colorante Camera a Lettura Multipla Doppio Laser Doppio Rilevatore Es. NIR o SBS

Software Sequenziamento automatico Controlla e ottimizza i parametri elettroforetici Normalizza le bande Sottrae il background Corregge l’effetto “Smile” Adatta gli algoritmi se mobilità e spaziatura dei picchi escono dal range

Problemi Reazione fallita: non presenta picchi definiti e ha un alto rumore di fondo Possibili Cause Possibili Soluzioni Il primer non trova sito di annealing Cambiare primer Il DNA presenta contaminazioni di vario tipo Ripreparare il DNA La quantità di DNA e' insufficiente Aumentare la quantità di DNA Aumentare la quantità di primer La quantià di primer è insufficiente Il primer è stato disegnato male, es. temperatura di melting troppo bassa Ridisegnare il primer

Problemi Campione che presenta rumore di fondo sufficientemente alto da causare ambiguità (N) nel riconoscimento dei picchi da parte del software Possibili Soluzioni Possibili Cause La quantità di DNA e' insufficiente e il segnale troppo debole Aumentare la quantità di DNA Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione Purificare meglio il DNA Ci sono altri templati contaminanti Ripreparare il DNA

Perdita di risoluzione precoce per cui i picchi Problemi Perdita di risoluzione precoce per cui i picchi sono sempre meno definiti Possibili Cause Possibili Soluzioni Il DNA presenta contaminazioni che inibiscono la reazione Purificare meglio il DNA

Siti multipli di attacco del primer sul DNA Problemi Sequenza doppia dopo un tratto buono Possibili Cause Possibili Soluzioni Clone o PCR multiple con stesso tratto iniziale, es. vettore Ripreparare DNA in modo da avere un tipo di templato unico Siti multipli di attacco del primer sul DNA Cambiare primer Mutazione frame shift Slittamento dopo una regione omopolimerica

Problemi Sequenza fuori scala Possibili Cause Possibili Soluzioni Troppo DNA Riquantizzare e ridurre la quantità di DNA Struttura secondaria che blocca la reazione Pretrattare con DMSO

Problemi Regione ricca in GC Possibili Cause Possibili Soluzioni Struttura secondaria che impedisce l'avanzamento della polimerasi perchè, per effetto dell'alta Tm del tratto di DNA, i due filamenti non si separano bene Sequenziare un prodotto di PCR amplificato sostituendo il 75% del dGTP con 7-deaza-dGTP Modificare il ciclo standard di sequenziamento con temperature più alte

Sequenziamento automatico: Applicazioni in ambito biomedico

Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici precedentemente localizzate con analisi di linkage) Primer walking Shotgun sequencing utilizzo di vettori di clonaggio Vettori fagici a singolo filamento Vettori plasmidici a doppio filamento Vettori fagomidici Vettori per grossi inserti di DNA Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale utilizzo di PCR

Tecnica del “Chromosome Walking” Mapping Sequenziamento di Library Progetto Genoma

Sequenziamento Ex Novo Uso di Primers Universali Es. M13 Tecnica del “Random Sequencing” Assemblaggio ed Allineamento delle sequenze tramite Computer Sfrutta l’Overlapping dei vari frammenti

Le finalità principali del progetto genoma riguardano l'acquisizione i informazioni utili per individuare l'eventuale implicazione di alterazioni nella sequenza del DNA nello sviluppo di patologie genetiche nell'uomo, e per comprendere le basi genetiche dell'evoluzione e del funzionamento dell'organismo umano

Sintesi di Oligonucleotidi analisi dell’espressione genica farmacogenomica Probe per Microarray SNPs Oligonucleotidi antigene/antisenso

Dare un senso ai dati di sequenza non è facile!! Isole CpG: la citosina può essere metilata nei geni inattivi Sequenze di siti di splicing in 5’ e 3’: come marcatori per gli introni e le zone di confine con gli esoni ORF: mRNA CUUAGCGUAGCUACUAGACUAG fase 1 CUU/AGC/GUA/GCU/ACU/AGA/CUA/G fase 2 CU/UAG/CGU/AGC/UAC/UAG/ACU/AG fase 3 C/UUA/GCG/UAG/CUA/CUA/GAC/UAG Open reading frame

Perché sequenziare anche organismi diversi da Homo Sapiens? Ad esempio per confrontare le sequenze altamente conservate, è più probabile che codifichino proteine funzionalmente importanti

Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale Sequenziamento di DNA o cDNA sconosciuto ( es. per caratterizzare regioni del DNA e trascritti genici precedentemente localizzate con analisi di linkage) Primer walking Shotgun sequencing utilizzo di vettori di clonaggio Vettori fagici a singolo filamento Vettori plasmidici a doppio filamento Vettori fagomidici Vettori per grossi inserti di DNA Sequenziamento di DNA o cDNA conosciuto per analisi mutazionale utilizzo di PCR

Comparativa e/o Mutazionale Uso Diagnostico Applicazione non di routine Monitoraggio pazienti in terapia Test di Genotyping Es. HIV Implicazioni Terapeutiche

Dimensione della mutazione Bandeggio cromosomico Poliploidie Aneuploidie Genoma Cromosoma Gene Fish di interfase Fish cromosomica Riarrangiamenti cromosomici Piccole delezioni/duplicazioni Genetica molecolare Delezioni/duplicazioni geniche Delezioni/duplicazioni nucleotidiche Mutazioni nucleotidiche Sequenziamento

Mutazione di un singolo nucleotide

Mutazioni per inserzione o delezione di nucleotidi in eterozigosi

Sequenziamento del tratto nucleotidico delle immunoglobuline (Ig) relativo al riarrangiamento della regione variabile CDR3 specifica del clone tumorale, da utilizzare in neoplasie linfoidi di tipo B per il monitoraggio della malattia minima residua e come base per la produzione di vaccini anti-idiotipici paziente-specifici.

Sequenziamento della VH-CDR3 Pession et al, Leuk Lymphoma 2003

Sequenziamento regione CDR3 del TCR per caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo REGIONI CHE DETERMINANO LA COMPLEMENTARIETA’

Sequenziamento regione CDR3 del TCR per caratterizzazione cloni di linfociti T in vitro/vivo Montagna et al int.j of cancer 2004

Genotipizzazione del genoma virale del lentivirus HIV, responsabile della sindrome da immunodeficienza acquisita umana (AIDS) una delle caratteristiche di questo virus è quella di andare in contro spesso a mutazioni casuali nel proprio genoma. ne consegue la selezione di ceppi resistenti ai farmaci

HIV ViroSeq Kit (Applied Biosystems Inc.) Individuazione Resistenze farmaci in pazienti non rispondenti TRUGENETM HIV-1 Genotyping Kit (Visible Genetics Inc)

Software allinea sequenza con WT HIV Software allinea sequenza con WT Rileva Mutazioni Regole che correlano singole o combinazioni di mutazioni al grado di resistenza per ogni farmaco Accesso a Banca Dati

Valutazione dello stato di metilazione di un gene ed in particolare del suo promotore Tecnica del bisufilto Il trattamento con bisulfito converte le citosine non metilate in timine Le citosine metilate (quelle delle isole CpG) rimangono tali Attenzione nel progettare i primers !! (escludere le parti con CpG) Decitabina: demetilante inibendo la DNA metil-transferasi LAM in particolare con riarrangemento di MLL Dott.ssa Formica, dott.ssa Dan, lab. Oncoped.

Elenco dei siti che contengono informazioni sul Progetto Genoma Umano e sui frammenti di DNA sequenziati.

Il clonaggio dell’intero genoma umano non è difficile tecnicamente e sono disponibili genoteche in fagi od in cromosomi artificiali di lievito abbastanza ampie da contenere diverse volte il genoma umano; ma il DNA di queste genoteche è stato clonato in modo casuale dal genoma. Perché abbia un senso il DNA in questi cloni deve essere strutturato nell’ordine corretto, in modo da poter ricostruire il genoma , o suoi frammenti che siano abbastanza ampi da contenere porzioni di sequenze biologicamente interessanti.

(sintomatologia, storia familiare) Sospetto clinico (sintomatologia, storia familiare) Isolamento dal sangue periferico di linfociti circolanti Analisi del cariotipo Estrazione del DNA Amplificazione tramite PCR Southern blot Diagnosi citogenetica Corsa su gel SSCP RFLP sequenziamento Creazione o distruzione di un sito di restrizione diagnosi di delezioni inserzioni duplicazioni identificazione di nucleotidi alterati diagnosi di specifiche mutazioni puntiformi