CARATTERIZZAZIONE ELETTROFISIOLOGICA DI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI CARDIOMIOCITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI “IN GITA A FIRENZE!!!” 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

Università degli Studi di Firenze Dipartimento di Farmacologia Preclinica e Clinica "Mario Aiazzi Mancini" FACOLTA’ DI MEDICINA 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

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IL CUBO 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

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CENTRI OSPITATI Centro Interdipartimentale di Servizi di Spettrometria di Massa (C.I.S.M.)      Centro Interuniversitario di Medicina Molecolare e Biofisica Applicata (C.I.M.M.B.A.) Centro per i Servizi di Stabulazione degli Animali di Laboratorio (Ce.S.A.L.)      30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

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LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA CARDIACA COSA FANNO NEL C.I.M.M.B.A? LABORATORIO DI ELETTROFISIOLOGIA CARDIACA 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

Rimodellamento Elettrofisiologico e Molecolare della cellula e tessuto cardiaco durante lo sviluppo fisiologico e durante alcune patologie cardiache Studio di farmaci antiaritmici e delle sostanze che modulano la frequenza cardiaca. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

QUALI MODELLI? Cardiomiociti ex-vivo, isolati da campioni di cuore (umano o animale) patologico; Cardiomiociti in vitro: -cardiomiociti ottenuti dal differenziamento di cellule staminali embrionali -cardiomiociti immortalizzati; Cellule trasfettate per lo studio delle isoforme e della regolazione dei canali HCN, che mediano la corrente If. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

POTENZIALI DI MEMBRANA; POTENZIALI D’AZIONE; PER CAPIRCI: COSA HO FATTO IO? ASSISTITO AD ALCUNI ESPERIMENTI DI PATCH-CLAMP ESEGUTI CON DIVERSI SET-UP SU CARDIOMICITI DERIVATI DA CELLULE STAMINALI EMBRIONALI, VOTLI A RACCOGLIERE DATI SU: CORRENTI IONICHE; POTENZIALI DI MEMBRANA; POTENZIALI D’AZIONE; EFFETI DI FARMACI E ALTRE SOSTANZE SU TALI GRANDEZZE. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

10.000 EURO L’iter delle cellule: PRODOTTE IN AUSTRALLIA DIFFERENZIATE IN SVIZZERA (GINEVRA) FATTE INVECCHIARE E CARATTERIZZATE A FIRENZE 10.000 EURO 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

Più difficili da conservare. INVECCHIAMENTO EARLY  15-40: Più facile da mantenere. LATE 50-110: Più difficili da conservare. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

EARLY: LATE: ICal; Ito IKr; IK1; If  sparisce; 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

PATCH -CLAMP PRIMO PASSO: INVECCHIAMENTO SECONDO PASSO: DIVISIONE (ENZIMA, VINCERE ELASTICITA’) TERZO PASSO:PIASTRINE (SOSPESO ENZIMA, VETRO) QUARTO PASSO: SOLUZIONI 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA; UNICA. INTRA (ELETTRODO): FISIOLOGICA; IONI DI SELZIONE; EGTA. PH=7.2; PRESSIONE OSMOTICA PARI ESTERNA; UNICA. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

DIFFERENZIATE EXTRA (PIASTRINA): TYRODE NaCl  140 mM; KCl  5,4 Mm; MgCl2 1,2 mM; Glucosio; HEPES (Acido); pH=7.3 Inseguito CaCl2 2mM; DIFFERENZIATE 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

Set-up: insieme di tutti gli elementi che permettono di fare la misura microscopio; amplificatore Axon; multi canale; braccio e elettrodi; provette con dentro le soluzioni extra-cellulari; perfusore per fare entrare le soluzioni nei vetrini; Aspiratore (occhio posizionamento); Aspiratore per suzione Rilevatore temperatura. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

SEAL Elettrodo lontano Seal=200 MΏ; Elettrodo appoggiato Seal=3 MΏ; Suzione Seal=50 MΏ; Rottura Seal=80 MΏ; Perfusione e ulteriore suzione=100 MΏ. Il GΏ E’ UN SOGNO!!!!!!! PROBLEMI DI PERFUSIONE (TROPPO, POCO…) TENUTA DELL’HOLDER. 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

PROTOCOLLO PULSE 2 mV I=V/Rseal  Rseal sale  I scende PERFUSIONE: AIUTA LA FORMAZIONE DEL SEAL DIFFICOLTA’: CELLULE PICCOLE E PIATTEINCUBAZIONE; ROTTURA OVERLOAD 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana; POSSO ANCHE CALCOLARE Capacità di membrana (automatico); Reisitenza di membrana; Time costant Resistenza foro (apertura protocollo) capacità foro; Se c’è del leakage si elimina inserendo una resistenza in serie al seal (set-up nuovo). 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

STUDIO DELLE CORRENTI E DEI POTENZIALI Perfondere con la soluzione extra adatta; Applicare un protocollo; Registrare; Fare esperimenti con protocolli e soluzioni extra diverse (perfusione, aspirazione); Ricominciare; 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

If 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

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ESPERIMENTO ISOPRENALINA: ANTAGONISTA DEI RECETTORI BETA-ADRENERGICI (AUMENTA If) PER VEDERE COME VIENE MODULATA If NEL CORSO DELLA MATURAZIONE DELLE CELLULE (CAMBIAMENTO CANALE) REVERSIBILITA’  LAVAGGIO ACETILCOLINA/CARBACOLO (ANALOGO STABILE): CORRENTE DI POTASSIO, POICHE’ VENGONO ATTIVATI I RECETTORI MUSCARINICI CHE AUMENTANO LA Gk 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

INaCa 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

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REGISTRAZIONI 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI

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THANKS TO ALL THE C3MIGers 30 aprile 2009 EMANUELE SALIMBENI