METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione di radiazione elettromagnetica con la materia Da tempo sono tra i metodi di rivelazione e quantificazione più impiegati in Chimica Analitica Clinica Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie molecolari che atomiche Assorbimento Emissione

METODI COLORIMETRICI E SPETTROFOTOMETRICI Sono un gruppo di tecniche analitiche che si basano sulla interazione di una radiazione elettromagnetica con la materia Esistono diversi tipi di metodi, basati sia su interazioni con specie molecolari che atomiche

MECCANISMO DELL’INTERAZIONE In funzione del tipo di interazione utilizzato, possiamo distinguere metodi di assorbimento e di emissione. Assorbimento: la luce viene assorbita da un atomo, ione o molecola portandoli ad un più alto stato di energia Emissione: rilascio di un fotone da parte di un atomo, ione o molecola portandoli ad un più basso stato di energia

LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (I) Energia del fotone = h h = costante di Planck (6,626 x 10-34 J s)  = frequenza (s-1) Unità di  più comuni: nm = 10-9 m Å = 10-10 m m = 10-6 m  = c c = velocità della luce All’aumentare di  la frequenza e l’energia del fotone diminuiscono

LE RADIAZIONI ELETTROMAGNETICHE (II) Tipo Lunghezza d’onda Energia Interazione  < 0,1 nm emissione nucleare raggi X 0,1-10 nm transizioni elettroniche (elettroni interni) UV 10-380 nm transizioni elettroniche (elettroni di valenza) Vis 380-800 nm transizioni elettroniche (elettroni di valenza) IR 800 nm-100 m transizioni vibrazionali Microonde 100 m- 1 cm transizioni rotazionali onde radio 1 cm- metri assorbimento nucleare

LO SPETTRO ELETTROMAGNETICO n = c / l E = hn Energia 10-14 10-12 10-10 10-8 10-6 10-4 10-2 1 102 104 106 108 1010 1022 1019 1017 1015 1014 103 10-3 Ultravioletto Visibile Infrarosso Raggi cosmici Raggi gamma Raggi X Ultravioletto Visibile Infrarosso Microonde Radar Televisione NMR Radio Ultrasuoni (udibile) Suoni Infrasuoni Frequenza [Hz] Lunghezza d’onda [m]

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Una sostanza assorbe la luce solo quando l’energia della radiazione corrisponde a quella necessaria per far avvenire una transizione Le transizioni possono essere: Elettroniche Vibrazionali Rotazionali Le ultime due riguardano solo le molecole

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Transizioni elettroniche Provocano modifiche nella distribuzione degli elettroni di un atomo o di una molecola: Molecola (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali molecolari)  * n n* Atomo (ridistribuzione degli elettroni negli orbitali atomici)

TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO ATOMICO DE S0 S2 S0 S1 I l

SPETTRO DI ASSORBIMENTO ATOMICO Anche con atomi, che è il caso più semplice, si ha un processo di assorbimento relativamente complesso. L’atomo di idrogeno presenta uno spettro di assorbimento “a righe” complesso dovuto a transizioni elettroniche all’interno dei sottolivelli s,p,d,f l

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Transizioni vibrazionali Causano modifiche nella lunghezza di un legame e quindi nella separazione media di due nuclei (IR) A B A B Transizioni rotazionali Causano modifiche dell’energia di una molecola quando essa ruota rispetto al suo centro di gravità (microonde) A----B A----B

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO L’assorbimento della luce da parte delle molecole è un processo molto complesso In una molecola ogni livello di energia elettronica è suddiviso in un certo numero di sottolivelli vibrazionali In aggiunta ciascun sottolivello vibrazionale è ulteriormente suddiviso in sottolivelli rotazionali

IL PROCESSO DI ASSORBIMENTO Livelli Elettronici (interazioni UV) Sotto-livelli Vibrazionali (interazioni IR) Sotto-livelli Rotazionali (interazioni microonde)

ASSORBIMENTO MOLECOLARE L’interazione con una molecola e l’assorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali. Le interazioni con altre molecole avranno anch’esse un effetto, con il risultato che lo spettro di assorbimento sarà a “bande” (ci saranno talmente tante transizioni che sarà impossibile distinguere le une dalle altre).

ASSORBIMENTO MOLECOLARE TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE E S0 S1 S2 I l Energia dei livelli elettronici Energia dei livelli vibrazionali Energia dei livelli rotazionali Transizioni elettroniche

ASSORBIMENTO MOLECOLARE TRANSIZIONI ELETTRONICHE NELLA FORMALDEIDE Transizione n * (285 nm)  * (187 nm) H C O

ANALISI QUALITATIVA UV/Vis, IR La identificazione di un composto si può effettuare sulla base del suo spettro di assorbimento, mediante confronto con lo spettro di un materiale noto o di uno standard di riferimento. Ciò viene fatto principalmente con la tecnica IR poiché lo spettro IR contiene più informazioni rispetto a quello UV e Vis.

UV Visible Near IR ANALISI QUALITATIVA SPETTRI UV/Vis, IR L’assorbimento di radiazioni nel UV, Vis e IR copre un ampio range di lunghezze d’onda. Eseguendo una scansione, cioè misurando l’assorbimento alle diverse lunghezze d’onda, si ottiene lo spettro di assorbimento della sostanza in esame Esempio di spettro di assorbimento molecolare: Lunghezza d’onda UV Visible Near IR

ANALISI QUALITATIVA SPETTRI UV/Vis, IR Gli spettri UV e Vis si ottengono con lo stesso strumento mentre quelli IR, a causa soprattutto dei differenti materiali e sorgenti necessari, richiedono un altro tipo di strumentazione. Le informazioni che si ottengono sono diverse: UV/Vis - Transizioni elettroniche IR - Transizioni vibrazionali (interazioni di legame)

COLORE E TRASMISSIONE DELLA LUCE L’occhio umano vede il colore complementare di quello assorbito

ASSORBIMENTO E COLORE COMPLEMENTARE 650-780 595-650 560-595 500-560 490-500 480-490 435-480 380-435 rosso arancio giallo-verde verde verde-bluastro blu-verdastro blu violetto blu-verde porpora rosso-porpora giallo Lunghezza d’onda (nm) Colore assorbito Colore complementare 800 700 600 500 400

P P - dP dN ANALISI QUANTITATIVA La legge fondamentale su cui si basano i metodi di assorbimento è quella di Lambert e Beer la quantità di luce assorbita da una soluzione è funzione della concentrazione della sostanza assorbente e della lunghezza del cammino ottico P P - dP dN P = potenza della radiazione incidente N = numero di molecole che assorbono nel cammino ottico K = costante di proporzionalità

ANALISI QUANTITATIVA Poiché N dipende sia dalla concentrazione c che dal cammino ottico b si ha: a è comunemente definita come “assorbività” ed include anche il termine di conversione dei logaritmi da base e a base 10:

T= P/P0

P0 c P b ANALISI QUANTITATIVA Il rapporto P/P0 è la misura della luce che passa attraverso la soluzione e non viene assorbita P0 c b P P/P0 è anche denominata Trasmittanza (T) -logT = A dove A viene definita Assorbanza A = ebc

LA LEGGE DI LAMBERT E BEER Concentrazione Assorbanza 1.5 0.0 0.5 1.0

EQUAZIONI FONDAMENTALI

DETERMINAZIONE DELLA ASSORBIVITA’ Ogni strumento presenta caratteristiche diverse quindi è meglio determinare l’assorbività utilizzando standard E’ possibile utilizzare qualsiasi unità di concentrazione: Molarità, Normalità, ppm, ecc. Se la concentrazione viene espressa in Molarità ed il cammino ottico in cm, l’assorbività viene definita come assorbività molare () ed ha unità M-1cm-1

MISURA DELL’ ASSORBANZA Se si ha una piccola variazione di  durante le misure e non si è al valore di max si potrebbe ottenere una notevole variazione nella risposta Piccolo errore Grande Stessa variazione di lunghezza d’onda

MISURA DELL’ ASSORBANZA La determinazione della concentrazione di una soluzione può essere effettuata mediante due approcci di base: L’assorbività della sostanza è nota o è stata già determinata mediante standard Metodo del rapporto: si basa sulla misura dell’assorbanza di uno standard noto e del campione incognito

1: Una soluzione di Co(H2O)2+ presenta un’assorbanza a 530 nm in una cella di 1.00 cm. Il valore dell’assorbività molare e è 10 Ln-1cm-1. Qual è la sua concentrazione? A = ebc c = A / eb C = 0.20 / 10 x 1 = 0.020 M

Questo metodo considera che si lavora nel range lineare. 2: L’assorbanza di una soluzione di MnO4- è 0.500 a 525 nm. Una soluzione 1.0x10-4 M di MnO4- presenta un’assorbanza di 0.200 quando è stata misurata alle stesse condizioni. Determinare la concentrazione della soluzione a concentrazioni non nota. In questo esempio non si conosce la lungehzza della cella, ma siccome è la stessa per le due misure, non è necessario conoscerla. Quindi è facile calcolare il valore della concentrazione incognita: Cx = (0.500/0.200) 1.0x10-4 = 2.5x10-4 M Questo metodo considera che si lavora nel range lineare.

ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA Sebbene nella legge di Lambert e Beer compaia l’assorbanza della soluzione, la grandezza fisica che viene effettivamente misurata è la trasmittanza. L’errore nella determinazione di una concentrazione mediante una misura spettrofotometrica (Dc) è quindi legato all’errore che si ha nella misura della trasmittanza (DT). Applicando la legge sulla propagazione degli errori alla legge di Lambert e Beer si ha: Dc/c = (0.4343 / TlogT) DT

ERRORE NELLA MISURA DELL’ ASSORBANZA L’andamento di Dc/c in funzione di T è il seguente: Errore relativo in funzione della %T Errore relativo su conc. 80% 20% %T

MISURA DELL’ ASSORBANZA Deviazione dalla relazione lineare Molte sostanze danno una risposta lineare solo in un certo intervallo di concentrazione Questa deviazione potrebbe essere dovuta al fondo, ad una interferenza o ad una mancanza di sensibilità Ambito lineare Questa deviazione potrebbe essere dovuta ad un auto-assorbimento o ad un insufficiente passaggio della luce attraverso la soluzione

SPETTROFLUORIMETRIA-LUMINESCENZA Con il termine luminescenza si indicano tutti quei processi (fluorescenza, fosforescenza) che comportano l’emissione di radiazione da parte delle molecole. La luminescenza può essere indotta da diversi processi, fra i quali l’assorbimento di radiazione. In tal caso si parla di fluorescenza e fosforescenza, che si verificano ad una energia inferiore a quella alla quale la radiazione viene assorbita, e lo spettro di emissione è approssimativamente l’immagine speculare di quello di assorbimento. assorbimento emissione Intensità di emissione e (M-1cm-1) l

ASPETTI QUANTITATIVI Le misure di emissione non sono misure assolute: Per effettuare misure quantitative è quindi indispensabile utilizzare una curva di calibrazione E’ possibile dimostrare che, quando l’assorbanza della soluzione è sufficientemente bassa (A  0,05) esiste una proporzionalità diretta fra l’intensità dell’emissione PF e la concentrazione: dove P0 è la potenza della radiazione incidente e k è una costante che contiene, fra l’altro, il valore della resa quantica di emissione dell’analita PF A  0,05 concentrazione

SPETTROFLUORIMETRIA vs. SPETTROFOTOMETRIA Spettrofotometria Spettrofluorimetria Applicabilità Ampia Ristretta (relativamente poche sostanze emettono) Intervallo di linearità Ampio Ristretto Sensibilità (oppure Media Elevata limite di rivelazione) (è possibile utilizzare rivelatori più sensibili o aumentare P0)

BIOLUMINESCENZA E CHEMILUMINESCENZA La luminescenza è l’emissione di radiazione elettromagnetica nell’UV, visibile o IR da parte di atomi o molecole come risultato della transizione da uno stato elettronicamente eccitato ad un livello energetico più basso, solitamente lo stato fondamentale La chemiluminescenza (CL) è un fenomeno di luminescenza in cui l’energia per generare lo stato elettronicamente eccitato deriva da una reazione chimica La bioluminescenza (BL) è un fenomeno di chemiluminescenza nel visibile che si verifica in organismi viventi

APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA Si parla di chemiluminescenza quando l’emissione non è indotta da assorbimento di radiazione ma da una reazione chimica. Il numero di analiti naturalmente luminescenti è relativamente ristretto. In molti casi è però possibile rendere luminescenti analiti non emittenti mediante derivatizzazione, ovvero attraverso una reazione chimica indicatrice che comporta il legame dell’analita ad una specie luminescente. - Luminol (used to detect blood) - phenyl oxalate ester (glow sticks) A + B  C*  C + hn

Luciferase gene cloned into plants APPLICAZIONI DELLA LUMINESCENZA Luciferin (firefly) Bioluminescenza “Glowing” Plants Luciferase gene cloned into plants

STRUMENTAZIONE PER SPETTROFOTOMETRIA I componenti principali della strumentazione UV/Vis e IR sono simili, indipendentemente dalla radiazione che deve essere misurata Ogni strumento comprenderà i seguenti componenti: sorgente di luce cella per il campione selettore di lunghezza d’onda rivelatore

Schema a blocchi di un tipico spettrofotometro UV/ Vis per assorbanza STRUMENTAZIONE Schema a blocchi di un tipico spettrofotometro UV/ Vis per assorbanza risposta Campione Sorgente Selettore di  Rivelatore Nelle misure di luminescenza l’emissione di radiazione da parte del campione è ottenuta o mediante eccitazione del campione stesso con radiazione di un’opportuna lunghezza d’onda o per reazione chimica risposta Sorgente Selettore di  Rivelatore Campione Chemiluminometro

CONTENITORI PER IL CAMPIONE (CUVETTE) Devono essere trasparenti a tutte le  che si utilizzano Devono essere di geometria (cammino ottico) definita Quelle più comunemente utilizzate per analisi quantitative sono parallelepipedi con cammino ottico di 1 cm quarzo o silice fusa vetro o plastica KBr, NaCl UV Visibile IR Cuvette standard volume complessivo 2-3 ml volume complessivo 0,2-1 ml a b Intervallo di trasparenza: Silice 150-3000 nm Vetro 375-2000 nm Plastica 380-800 nm

Fotomoltiplicatori (PM) RIVELATORI Fotomoltiplicatori (PM) anodo catodo catodi intermedi In questi rivelatori la radiazione colpisce un catodo iniziale, provocando l’emissione di elettroni: effetto fotoelettrico Gli elettroni prodotti vengono moltiplicati attraverso la collisione con una serie di catodi intermedi La corrente misurata è così amplificata, rispetto a quella iniziale, di un fattore molto elevato (106 – 107)

SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO monocromatore fenditura di ingresso fenditura di uscita cella porta campione rivelatore sorgente elemento disperdente (prisma/reticolo)

Rivelatori a stato solido: fotodiodo Quando si applica un opportuno potenziale ad un cristallo di Si drogato si ottengono due aree: In condizioni di riposo non si ha passaggio di corrente regione p regione n n - ricche di elettroni p - ricche di cariche positive

RIVELATORI Rivelatori a stato solido: fotodiodo Quando il fotodiodo viene esposto alla luce, la radiazione incidente produce nuove coppie di cariche positive e negative all’interno del materiale, permettendo il passaggio della corrente. L’intensità di corrente è proporzionale alla quantità di luce incidente. Un fotodiodo costa meno di un fotomoltiplicatore.

RIVELATORI Array di fotodiodi E’ costituito da una serie di fotodiodi, ricavati ad intervalli di spazio regolari su di un microchip. Ciascuno fotodiodo risponde ad una data lunghezza d’onda Inserito in uno strumento con una ottica opportuna, questo tipo di rivelatore permette di misurare simultaneamente radiazioni di diverse lunghezze d’onda reticolo

SPETTROFOTOMETRO A SINGOLO RAGGIO A SERIE DI DIODI reticolo lampada a deuterio fenditura cella porta campione otturatore lampada a tungsteno rivelatore a serie di diodi lente Questi strumenti sono in grado di effettuare la misura in un tempo brevissimo (anche meno di un secondo), permettendo quindi di studiare anche variazioni spettrali che avvengono in tempi molto brevi. Possiedono però certe limitazioni: ad esempio, la risoluzione è limitata dal numero degli elementi del rivelatore a serie di fotodiodi, e di solito non è minore di 0,5-1 mm.

SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO Uno spettrofotometro a doppio raggio misura contemporaneamente l’assorbimento della radiazione da parte del campione e del riferimento Il rapporto fra queste due grandezze rappresenta l’assorbimento dovuto all’analita, ed è indipendente da tutte le altre variabili legate alla variazione della lunghezza d’onda Esistono due tipi di spettrofotometri a doppio raggio: spettrofotometri a doppio raggio nel tempo spettrofotometri a doppio raggio nello spazio

SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NEL TEMPO chopper sorgente monocromatore fenditura di ingresso fenditura di uscita campione rivelatore elemento disperdente riferimento Uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo utilizza un “chopper” (di solito uno specchio rotante) per inviare alternativamente la radiazione attraverso il campione ed attraverso il riferimento La radiazione alternativamente trasmessa da campione e riferimento viene poi misurata da un unico rivelatore

SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO Esistono limitazioni applicative per gli spettrofotometri a doppio raggio nel tempo: ad esempio non è possibile misurare correttamente variazioni di assorbanza che avvengono a velocità confrontabili o maggiori di quella di rotazione del chopper. Non è quindi possibile effettuare studi cinetici che coinvolgono reazioni veloci In uno strumento a doppio raggio nello spazio il fascio di radiazione viene diviso in due parti mediante uno specchio fisso, ed i due fasci vengono inviati rispettivamente sul campione e sul riferimento Non esistono parti mobili, ed è possibile studiare anche processi molto veloci Sono però necessari due rivelatori distinti, che devono possedere caratteristiche simili

SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NELLO SPAZIO specchio divisore di fascio sorgente monocromatore fenditura di ingresso fenditura di uscita campione rivelatore elemento disperdente riferimento

CRITERI DI SCELTA DI UN METODO COLORIMETRICO Specificità della reazione Campo di proporzionalità A/[C] Stabilità del colore Riproducibilità Limpidità della soluzione Sensibilità Convenienza (tempo/costo)

METODI DI DOSAGGIO DELLE PROTEINE Assorbimento diretto a 280 nm Kjeldahl (idrolisi e det. dell’azoto) Biureto (reattivo al rame) Lowry (rame + reattivo di Folin) Bradford (Coomassie Blu) (Fluorescamina)

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Metodo gravimetrico (pesata) Bisogna avere molto campione a disposizione ed allo stato puro altrimenti l’errore può essere molto elevato. Ha siti che possono reagire con altri gruppi, molecole,... Cromofori di una proteina: legame peptidico Tyr max a 276 nm Trp max a 280 nm Phe max a 256-260 nm (poco) ci si riferisce all’ aminoacido libero

Cromofori nelle proteine DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Cromofori nelle proteine Il legame peptidico (210 nm) Ponte disolfuro (250 nm) Centrato a 280 nm

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Metodo diretto E’ necessario avere a disposizione molta proteina (metodo assoluto). A 280 nm qual è il contributo di ciascun aa all’Assorbanza totale? e Phe Tyr Trp cambia da proteina a proteina Non c’è solo un problema di composizione ma di interazione fra anelli aromatici diversi Se ci sono più Tyr e non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che occupano sulla catena. Metodo indiretto Ad es. Bradford sono metodi relativi Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è marroncino. A 595 nm si misura l’Assorbanza del complesso PD e non D.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE METODI INDIRETTI Molto spesso non è importante sapere la quantità assoluta, ma avere un metodo riproducibile che sia sensibile e che permetta di valutare la quantità in maniera relativa (avendo a disposizione uno standard). Blu di Comassie si lega alle proteine, ma a tutte in egual misura? P + C PC L’equilibrio deve essere tutto spostato a destra Deve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante. Riassumendo: 1) la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine; 2) la reazione deve essere completa; 3) il colorante libero non deve assorbire.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Metodo di Lowry sensibilità: qtà inferiori a 10 mg/ml Quando si mescola alla soluzione proteica il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato di sodio) ed una soluzione di solfato di rame si sviluppa un colore blu-porpora che può essere letto a 600 nm. Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono. Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e triptofano. Reaction schematic for the Modified Lowry Protein Assay.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Metodi dell’acido bicinconinico (BCA). Simile al Lowry, dipende dalla conversione di Cu++ in Cu+ in condizioni alcaline che viene poi rilevato mediante reazione con il BCA per ottenere un color porpora letto a 562 nm. E’ più sensibile rispetto al Lowry (qtà inferiori a 0.5mg/ml) e più tollerante per la presenza di altri composti.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Bradford Protein Assay The Bradford assay is a protein determination method that involves the binding of Coomassie Brilliant Blue G-250 dye to proteins. The dye exists in three forms: cationic(red), neutral (green), and anionic (blue). Under acidic conditions, the dye is predominantly in the doubly protonated red cationic form (Amax = 470 nm). However, when the dye binds to protein, it is converted to a stable unprotonated blue form (Amax = 595 nm). It is this blue protein-dye form that is detected at 595 nm in the assay using a spectrophotometer or microplate reader.

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Work with synthetic polyamino acids indicates that Coomassie Brilliant Blue G-250 dye binds primarily to basic (especially arginine) and aromatic amino acid residues. The extinction coefficient of a dye-albumin complex solution is constant over a 10-fold concentration range. Thus, Beer's law may be applied for quantitation of protein. Certain chemical-protein and chemical-dye interactions interfere with the assay. Interference from non-protein compounds is due to their ability to shift the equilibrium levels of the dye among the three colored species.

Metodo di Bradford max = 595 nm Tietz Tietz

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE Selezione della proteina standard La proteina ideale da usare come standard è la forma assolutamente pura della proteina da dosare. In assenza di tale proteina si può usare un’altra proteina come standard relativo. Il miglior standard relativo deve dare una colorazione simile a quella della proteina da saggiare. Le proteine più usate come standars sono il BSA e la gamma-globulina

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI PROTEINE IN SOLUZIONE

APPLICAZIONI CLINICHE: SPETTROFOTOMETRIA DIRETTA Complesso giallo l=520 nm - H2O + + H2O Creatina Creatinina Picrato Reazione di Jaffe La creatinina è il prodotto di eliminazione per via renale della creatina: il tasso di creatinina è quindi un indice della funzionalità renale Possibili interferenze con composti chetonici, glucosio, proteine

METODI SPETTROFOTOMETRICI DIRETTI Determinazione dell’acido urico nel siero 1. Misura di assorbanza a 290 nm: assorbono altri costituenti 2. Aggiunta di uricasi: decomposizione del solo acido urico uricasi 3. L’allantoina non assorbe a 290 nm quindi la concentrazione dell’acido urico si ottiene per differenza

SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA I metodi spettrofotometrici indiretti fanno uso di reazioni enzimatiche Questi metodi coprono dal 50% al 70% delle analisi di un laboratorio clinico Sono molto sensibili perché sfruttano come risposta il turn-over del substrato Sono basati su reazioni primarie e reazioni indicatrici

SPETTROFOTOMETRIA INDIRETTA Determinazione del Glucosio con Glucosio Ossidasi (GOD) Reazione primaria GOD C6H12O6 + H2O + O2  Acido gluconico + H2O2 H2O2 + + HRP Reazione indicatrice fenolo Composto chinoide rosso-arancio lmax=510 nm 4-amminofenazone Reattivo di Trinder

E’ la reazione indicatrice piu’ impiegata in spettrofotometria TEST OTTICO DI WARBURG NAD NADH N + R H 2 O .. + H+ + 2e- + H+ 260 340 E’ la reazione indicatrice piu’ impiegata in spettrofotometria indiretta per applicazioni cliniche: Massimi di assorbanza separati permettono misure cinetiche

DENATURAZIONE DEL DNA

ASSORBIMENTO MOLECOLARE TRANSIZIONI ELETTRONICHE E SPETTRO DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE E S0 S1 S2 I l Energia dei livelli elettronici Energia dei livelli vibrazionali Energia dei livelli rotazionali Transizioni elettroniche L’interazione con una molecola e l’assorbimento coinvolgono quindi non solo livelli elettronici, ma anche sotto-livelli vibrazionali e rotazionali. Lo spettro di assorbimento è a “bande” in quanto ci sono talmente tante transizioni che è impossibile “vederle” distinte le une dalle altre.

Intensità di emissione SPETTRI DI EMISSIONE ED ECCITAZIONE eccitazione lem fissa lecc variabile emissione lem variabile lecc fissa assorbimento e (M-1cm-1) Intensità di emissione l l

CELLE PER IL CAMPIONE Cuvette standard volume complessivo 2-3 ml b Strato di liquido tra due lastre di NaCl “Cuvetta” per IR Cuvette per sistemi a flusso Cella per gas

SELETTORE DI LUNGHEZZA D’ONDA Il ruolo di un selettore di lunghezze d’onda è quello di far sì che solo una  specifica arrivi al campione e/o al detector. Questo componente è fondamentale se: Si è interessati ad una singola lunghezza d’onda Si devono esplorare in sequenza diverse lunghezze d’onda (scansione), ad esempio per ottenere uno spettro di assorbimento

SELETTORE DI LUNGHEZZA D’ONDA Filtri interferenziali MAX = 2dn / N dove: d = spessore n = indice di rifrazione N = ordine Strato metallico semiriflettente Strato sottile di CaF2 o MgF2 d

RIVELATORI Rivelatori più comuni Tipo di intervallo di  proprietà uso Rivelatore (nm) misurata tipico Fototubo 150-1000 I corrente UV Fotomoltiplicatore 150-1000 I corrente UV/Vis Stato Solido 350-3000 varie varie Termocoppia 600-20000 I corrente IR Termistore 600-20000 I corrente IR

ELABORAZIONE DEL SEGNALE E RISPOSTA Il segnale in uscita dal rivelatore viene infine amplificato al fine di produrre un segnale facilmente misurabile. La maggior parte degli strumenti attualmente in commercio è in grado di eseguire ulteriori elaborazioni del segnale (medie, uso di filtri per migliorare la qualità del segnale, …) e di presentarlo in una forma adeguata (display, stampati, file dati, …). Spesso il sistema è anche in grado di effettuare tutti i calcoli necessari per avere direttamente il risultato dell’analisi.

SPETTROFOTOMETRO A DOPPIO RAGGIO NEL TEMPO Questo approccio riduce gli errori legati a variazioni nell’emissione della lampada e nella risposta del rivelatore, poiché l’assorbimento del campione viene misurato relativamente a quello del riferimento. Il rumore di fondo viene inoltre ridotto utilizzando un amplificatore “lock-in” che misura solo i segnali con la giusta frequenza, cioè quella con la quale il fascio di radiazione viene alternato fra campione e riferimento. Con uno spettrofotometro a doppio raggio nel tempo si possono ottenere facilmente spettri, ed il rumore di fondo viene notevolmente ridotto. R C Assorbimento del campione

SELETTORE DI LUNGHEZZA D’ONDA Reticoli Sono attualmente i monocromatori più utilizzati nella moderna strumentazione analitica Consistono di solito in una superfice riflettente contenente una serie di incavi paralleli Sono classificati in base al numero di linee/mm, che varia in funzione dell’intervallo di utilizzazione: - UV/Vis : 300-2000 linee/mm - IR : 10-200 linee/mm