La regolazione dell’espressione genica Anno scolastico 2005/06

Il cromosoma procariote E’ formato da una catena continua (circolare) di DNA a doppio filamento dello spessore di 2 nm di diametro; in E.coli contiene quasi 4,7 milioni di coppie di basi azotate ed è lungo più di 1 mm se completamente svolto.

I controllori dei geni Le cellule controllano l’espressione genica, ossia quali prodotti genici si ottengono, quando e in quali quantità. Proteine regolatrici e molecole segnale (come gli ormoni) appartengono ai sistemi di controllo: interagiscono tra loro, con il DNA, con l’RNA, con i prodotti genici I sistemi di controllo negativi bloccano un’attività cellulare, quelli positivi la promuovono; i loro effetti sono reversibili

I sistemi di controllo nei procarioti Sono a breve termine e riguardano soprattutto la velocità di trascrizione degli enzimi che agiscono nella digestione e nelle altre attività correlate alla crescita Il modello è quello dell’operone studiato da Jacob e Monod Francois Jacob, Jacques Monod, Andrè Lwoff gli scienziati francesi che hanno studiato la regolazione genica e formulato il modello dell’operone (Nobel 1965)

Operone batterico I geni vengono distinti in regolatori e strutturali Geni regolatori  codificano per proteine che “gestiscono” il programma (repressori o induttori della sintesi di proteine enzimatiche) Geni strutturali  codificano per le proteine enzimatiche. OPERONE  gruppo di geni che sintetizzano enzimi coinvolti in una catena di reazioni controllati dagli stessi geni regolatori

Il lattosio Il lattosio è un disaccaride formato da galattosio e glucosio Rappresenta per la cellula una fonte di glucosio da cui ricavare energia L’utilizzo del lattosio da parte del batterio richiede più enzimi (βgalattossidasi, permeasi) codificati da geni strutturali controllati dagli stessi geni regolatori = operone lac

Operone per il lattosio GENI regolatore promotore operatore Geni strutturali RNApolimerasi DNA RNA Proteina repressore attiva repressore inattiva lattosio trascrizione traduzione Il gene regolatore sintetizza la proteina repressore; può essere anche lontano dall’operone

Successione eventi: la repressione repressore attivato Induttore (lattosio) repressore legato all’operatore RNA polimerasi non può legarsi: trascrizione bloccata Il repressore viene codificato da un gene regolatore Promotore lac 1- in assenza del substrato (lattosio) la proteina repressore si lega a un tratto di DNA (gene operatore) e blocca l’accesso alla RNApolimerasi al gene promotore dal quale inizia la trascrizione dei geni strutturali

RNApolimerasi si lega al L’induzione 2- In presenza del substrato (induttore), questo si lega alla proteina repressore e libera l’operatore. 3- RNApolimerasi si lega all’operatore e inizia la trascrizione Induttore (substrato) legato al repressore RNApolimerasi si lega al promotore Inizia la trascrizione dei geni strutturali mRNA trascritto

Operone per il triptofano E’ controllato da un repressore che è inattivo quando si trova da solo, per essere attivo deve combinarsi con il triptofano, un aminoacido essenziale per la sintesi proteica. Se occorre E.coli può produrre autonomamente il triptofano ma, quando è possibile lo assorbe direttamente dall’ambiente

Operone con induttori Gli induttori agiscono rendendo più facile per l’RNA polimerasi il legame con il promotore, invece che bloccare l’RNA polimerasi come fanno i repressori

Sistemi di controllo negli eucarioti Negli eucarioti esistono anche sistemi di controllo a lungo termine e la regolazione genica è più complessa. Il differenziamento cellulare è la conseguenza di un espressione selettiva dei geni nelle diverse cellule Il controllo si effettua prima, durante e dopo la trascrizione

L’espressione dei geni può essere regolata a diversi livelli nella via che porta da DNA a RNA NUCLEO CITOPLASMA mRNA inattivo 5 mRNA degradazione DNA RNA transcript mRNA mRNA 1 Controllo di trascrizione 2 RNA processing 3 RNA trasporto 4 controllo traduzione Proteina

Geni e loro funzioni Gene regolatore Proteina repressore Gene promotore Gene operatore Geni strutturali Proteina repressore Sito di avvio della trascrizione del DNA in mRNA Sito di inserimento per repressore: blocco della sintesi dell’ mRNA enzimi RNA polimerasi promotore operatore

Il cromosoma eucariote Per stare in queste ridotte dimensione il DNA utilizza delle strutture proteiche attorno alla quale si compatta (istoni e proteine non istoni). I nucleosomi sono formati da un ottamero di istoni e su ognuno di essi si avvolge un filamento di DNA contenete 200bp. Essi poi si condensano ulteriormente in nucleofilamenti che si associano in anse su una struttura polisaccaridica detta Scaffold.

I livelli di condensazione della cromatina: schema che illustra le immagini al microscopio elettronico a trasmissione Il DNA della cellula interfasica forma delle anse su proteine Impalcatura.

Le cellule specializzate conservano tutto il loro potenziale genetico Esperimento di J.B.Gurdon: asporta i nuclei di cellule intestinali di girino e li impianta in cellule uovo di rana private del proprio nucleo. Le cellule uovo danno origine a nuove rane con le caratteristiche del girino donatore del nucleo → i nuclei delle cellule intestinali contengono tutte le informazioni necessarie per tutte le cellule dell’organismo

Condensazione del cromosoma ed espressione genica L’espressione genica è correlata al grado di condensazione del cromosoma La cromatina che durante l’interfase si despiralizza maggiormente è detta eucromatina, mentre quella che rimane più condensata e non viene trascritta è detta eterocromatina Uno dei 2 cromosomi X delle femmine di mammifero rimane sempre spiralizzato (corpo di Barr)

L’eterocromatina, ossia la cromatina più condensata dei nuclei interfasici, deriva dalla complessazione con proteine non istoniche. Ad esempio, a livello dei telomeri si legano alcune proteine che “silenziano” una regione più ampia di DNA

Gatta calicot Nelle sue cellule un cromosoma X porta l’allele dominante per la melanina, mentre l’altro specifica la pelliccia gialla Allo stadio di embrione, uno dei due cromosomi è stato disattivato in modo casuale in ciascuna delle cellule presenti in quel momento. In tutti i discendenti di quelle cellule è rimasto disattivato lo stesso cromosoma, lasciando funzionante un solo allele per il colore della pelliccia. Le macchie di colore differente dipendono da quale allele è stato disattivato

Cromosomi giganti Le cellule salivari delle larve di ditteri mostrano dei cromosomi giganti (per duplicazioni successive di DNA non seguite da divisione cellulare) Questi si presentano a bande scure e chiare, indice di una diversa condensazione del DNA e mostrano dei rigonfiamenti (puff) la cui posizione varia nel corso dello sviluppo I puff corrispondono a regioni di intensa sintesi di RNA e sono il segnale visibile dell’attivazione e disattivazione di specifici geni durante lo sviluppo

Fattori di trascrizione Un gene che codifica per una proteina può possedere un grande assortimento di sequenze di DNA coinvolte nella regolazione della trascrizione. Queste sequenze vengono definite elementi di regolazione e possono essere localizzate sia a monte sia a valle del punto d’inizio della trascrizione dell’RNA. Questi elementi regolatori possono legare dei fattori trascrizionali specifici,cioè proteine coinvolte nell’attivazione o nella repressione della trascrizione di un gene. Gli elementi regolatori in posizione più distale sono chiamati enhancers e sono necessari per ottenere il massimo grado di trascrizione per un dato gene. Esistono degli elementi, chiamati silencer, che hanno caratteristiche simili agli enhancer, ma che reprimono la trascrizione anziché attivarla.

Controllo post-trascrizionale I trascritti primari dei geni che specificano gli RNA sono generalmente delle molecole di RNA precursore o pre-RNA. Terminata la trascrizione, per ottenere degli RNA funzionali, le molecole di pre-RNAdevono essere modificate. Possiamo individuare due tipi di modificazioni principali: Modificazioni chimiche,nelle quali vengono modificate le basi (sia negli eucarioti che nei procarioti). Processamento dell’RNA, per il quale sequenze presenti nel pre-RNA sono eliminate in modo specifico e preciso (solo eucarioti).

Aggiunta di cappuccio e coda all’mRNA L’estremità 5’ è modificata dall’aggiunta di un cappuccio in seguito ad un processo chiamato 5’ CAPPING, questo comporta l’aggiunta di una guanina (7-metilguanosina) al nucleotide terminale in 5’, mediante un insolito legame 5’-5’, in contrapposizione al consueto legame 5’-3’.Il CAP serve per il corretto attacco al ribosoma. All’estremità 3’ viene aggiunta una sequenza di 50-250 A importante per la stabilità dell’m-RNA

Splicing Generalmente l’introne inizia con GU al 5’ e finisce con AG al 3’. Viene effettuato un taglio alla giunzione in 5’. L’estremità 5’ libera dell’introne si piega su se stessa formando un occhiello e si unisce ad una A, che fa parte di una sequenza chiamata sequenza del punto di Ramificazione. Taglio al sito di giunzione 3’ di splicing e ligazione delle due sequenze codificanti. Il processamento avviene in complessi specifici Spliceosoma costitutite da molecole ribonucleoproteiche

Alfa-tropomiosina: splicing alternativo specifico per tessuto

Controllo a livello della traduzione Tempo di sopravvivenza dell’mRNA: Può variare da qualche ora a qualche settimana maggiore è il tempo di sopravvivenza, più alto è il numero di proteine prodotte Presenza di proteine inibitrici che impediscono la traduzione dell’mRNA in proteina (es. produzione di emoglobina in assenza del gruppo eme) Suddivisione del polipeptide in segmenti finali più piccoli e attivi (es. insulina) Demolizione selettiva delle proteine

La disponibilità di fattori della traduzione regola l’espressione genica

Il silenziamento genico è stato scoperto da botanici che cercavano di rendere più intenso il colore dei petali della petunia: introdussero nelle piantine alcune copie aggiuntive di un gene noto per codificare un enzima chiave nella colorazione dei petali. Sorprendentemente, molte piantine così trattate non presentavano gli attesi colori intensi ma erano privi di colore. Senza volere, disattivando i geni che conferivano colore, avevano scoperto uno dei meccanismi con cui le cellule cercano di eliminare i genomi virali….

I MECCANISMI DEL SILENZIAMENTO GENICO Controllo post-trascrizionale (2 modalità) (è il caso del colore della petunia)

Piccoli RNA a interferenza e micro-RNA reprimono la traduzione di mRNA bersaglio. I microRNA inibiscono in maniera reversibile la traduzione; gli RNA a interferenza causano la degradazione dell’mRNA complementare. Questo meccanismo si è evoluto come difesa nei confronti dei virus.

RNA interferenza RNA interferenza è un meccanismo di “silenziamento post-trascrizionale”: un RNA a doppio-filamento (dsRNA) blocca, in modo specifico, l’espressione di geni omologhi attraverso l’appaiamento con l’mRNA bersaglio e la degradazione dello stesso. Questo processo rappresenta in piante e animali un sistema di difesa naturale contro infezioni causate da virus a RNA, nonché un possibile meccanismo di regolazione dei geni durante la crescita e lo sviluppo.

Il sistema iRNA La sua scoperta ha permesso ai ricercatori Andrew Fire, docente di patologia e genetica presso la Stanford University, e Craig Mello, ordinario di medicina molecolare alla University of Massachussets, di aggiudicarsi il premio Nobel 2006 per la medicina. Quasi tutte le cellule vegetali e animali hanno meccanismi interni che utilizzano forme insolite di RNA per silenziare in modo naturale i geni a uno a uno mediante l'RNAi. L’importanza di questa scoperta consiste anche nella possibilità mettere a punto di nuovi protocolli terapeutici, basati appunto sul silenziamento di geni collegati a malattie. Dagli esperimenti condotti sui vermi nematodi, Fire e Mello hanno scoperto che il meccanismo noto come RNAi viene attivato quando nella cellula sono presenti molecole di RNA a doppio filamento. L'RNA a doppio filamento innesca un processo che degrada le molecole di mRNA che contengono una sequenza complementare a quella dell'RNA a doppio filamento. Quando queste molecole di mRNA scompaiono, il gene corrispondente viene silenziato e non viene prodotta alcuna proteina del tipo codificato. Quando un gene estraneo, virus o trasposone compare nella cellula, questa, riconoscendolo come estraneo, attraverso un meccanismo che ancora non è stato compreso, lo induce a convertire il suo mRNA in RNA a doppio filamento, inducendo di conseguenza la risposta di inibizione.

Meccanismo L’RNA a doppio filamento incontra un enzima chiamato "Dicer", il quale taglia il lungo RNA in pezzi di circa 21-23 nucleotidi, gli siRNA. L’enzima taglia entrambi i filamenti in maniera leggermente sfalsata, così da lasciare due nucleotidi che sporgono ad ogni estremità. Successivamente i due filamenti dell’siRNA si separano e uno dei due entra a far parte di un complesso proteico, chiamato RISC, ossia Complesso di silenziamento indotto dall’RNA (RNA-Induced Silencing Complex). Un’opportuna disposizione dell’siRNA all’interno del complesso fa in modo che gli mRNA presenti in ogni momento nella cellula possano urtare contro di esso. Ma solo l’RNA messaggero perfettamente o quasi perfettamente complementare ad esso potrà aderire alla sua sequenza nucleotidica. Quando ciò si verifica un enzima chiamato "Slicer" taglia in due il filamento di mRNA, rendendolo inattivo e procede oltre, libero di catturare un altro mRNA. In tal modo il sistema iRNA utilizza i frammenti di mRNA a doppio filamento per identificare e inattivare gli RNA messaggeri corrispondenti.

RNA come silenziatore: i microRNA Sono stringhe di acido nucleico lunghe 19-22 basi non codificanti proteine Sono direttamente coinvolti nella genesi di molti tumori Queste molecole hanno la capacità di inibire la traduzione dell’mRNA in proteine. Sono regolatori endogeni dell’espressione genica che si attivano quando un’enzima li stacca da una molecola di RNA più lunga, tagliandola in punti strategici Una volta liberati individuano il loro bersaglio: l’mRNA che sta per essere tradotto in proteina Se non c’è perfetta complementarietà di basi con il bersaglio ne bloccano la traduzione legandosi ad esso. Se la complementarietà è totale ne causano la degradazione Il bersaglio possono essere mRNA che derivano da oncogeni o oncosopressori. Nel primo caso la perdita di microRNA attiva geni che sarebbe meglio restassero silenti. Nel secondo caso vengono silenziati geni protettivi che impediscono lo sviluppo tumorale.

Regolazione dell’espressione genica durante lo sviluppo I meccanismi di regolazione dell’espressione genica durante lo sviluppo non sono del tutto noti, ma si può delineare un modello valido in linea generale

Geni omeotici Sono gruppi di geni pressocchè identici che controllano l’abbozzo generale dell’organismo in specie animali anche molto diverse Hanno in comune una sequenza simile di circa 180 nucleotidi detta homeobox Sono attivati durante lo sviluppo sempre nello stesso ordine che corrisponde all’ordine con cui essi sono disposti nel cromosoma, ossia dall’estremità posteriore a quella anteriore del corpo

Sequenza di trasduzione del segnale Serie di cambiamenti che trasformano un segnale chimico che arriva su una cellula in una risposta specifica della cellula bersaglio La cellula che trasmette il messaggio secerne una molecola segnale La molecola si lega a un recettore sulla membrana della cellula bersaglio Il legame attiva delle proteine amplificatrici Viene attivato un fattore di trascrizione che attiva la trascrizione di uno specifico gene