OGM ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI PGM PIANTA GENETICAMENTE MODIFICATA PIANTA TRANSGENICA UNA PIANTA NELLA QUALE, MEDIANTE INGEGNERIA GENETICA, SONO STATE INTRODOTTE UNA O PIÙ COPIE DI UN GENE PROVENIENTE DA UN ORGANISMO DIVERSO O ULTERIORI COPIE DI UN GENE GIÀ PRESENTE NELLA STESSA SPECIE

BIOTECNOLOGIE l’uso e la manipolazione di organismi viventi, o di sostanze ottenute da questi organismi, per ottenere prodotti utili per l’umanità

Il termine biotecnologie è recente, ma la sua origine risale all’alba della civiltà, quando le donne iniziarono ad addomesticare animali e coltivare piante circa anni fa raccoglitoreagricoltore il cacciatore-raccoglitore faceva parte della natura ed era in competizione con gli altri animali per approvvigionarsi il cibo, l’agricoltore cominciò a modificare l’ecosistema adattandolo al fabbisogno degli uomini

Centri di Origine dell’agricoltura frumento, orzo, olivo, cipolla,lattuga uva riso, soia, arancio, tè, albicocco, pesco cetriolo, banana, noce, mango, cocco sorgo, miglio, pisello, caffè, melone, cocomero patata, fagiolo, ananas, mais, zucca, pomodoro, cotone, peperone

selezione artificiale (  8000 a.C.- presente) incrocio controllato ( presente) massimizzazione della variazione in laboratorio ( presente) mutagenesi, fusione di cellule

le MUTAZIONI sono alla base della diversità una mutazione può alterare un tratto e il tratto alterato è trasmesso alla progenie con la selezione artificiale l’uomo ha selezionato e propagato mutanti con caratteristiche di interesse mutazione nel gene della antocianina sintasi selezione della “Delicious” in Iowa, 1872 selezione della “Golden Delicious” in West Virginia, 1905 Miglioramento genetico tradizionale

Il progenitore selvatico della CAROTA produce radici bianche Le varietà colorate derivano da secoli di coltivazione-selezione Importata dall’Afghanistan per le foglie ed i semi aromatici Carote gialle e rosse sono apparse nell’VIII secolo Le moderne carote arancioni risalgono al XVII secolo in Olanda Oggi esistono varietà di vari colori che dipendono dal contenuto di carotenoidi Miglioramento genetico tradizionale

X mandarinoarancioclementinaX Miglioramento genetico tradizionale

AGRUMI arancio, arancio amaro, chinotto, limone, clementina, bergamotto, mandarancio, mapo, pompelmo, limetta, combava, lice, kumquat, lipo………... pomelo mandarino cedro progenitori Miglioramento genetico tradizionale

Origine delle specie di agrumi coltivate

Miglioramento genetico tradizionale Il miglioramento genetico ha portato ha notevoli differenze tra le varietà coltivate ed i progenitori selvatici Lycopersicon chmielewskii Progenitore del pomodoro Pomodoro coltivato

maisteosinte TEOSINTE è il progenitore selvatico del mais progenitore del frumento selvatico domesticato baccelli di pisello mais teosinte Miglioramento genetico tradizionale

pompelmo rosa (Texas red) ottenuto per radiazione il gene che codifica un enzima che degrada il pigmento rosso in uno incolore è stato reso knock out grano duro CRESO (90% della produzione nazionale di grano duro) ottenuto per irraggiamento con neutroni della varietà Cappelli INDUZIONE DI MUTAZIONI MEDIANTE RADIAZIONI Miglioramento genetico tradizionale

Tutte le varietà commerciali sono state ottenute attraverso il miglioramento genetico tradizionale

OGM ORGANISMI GENETICAMENTE MODIFICATI PGM PIANTA GENETICAMENTE MODIFICATA PIANTA TRANSGENICA UNA PIANTA NELLA QUALE, MEDIANTE INGEGNERIA GENETICA, SONO STATE INTRODOTTE UNA O PIÙ COPIE DI UN GENE PROVENIENTE DA UN ORGANISMO DIVERSO O ULTERIORI COPIE DI UN GENE GIÀ PRESENTE NELLA STESSA SPECIE

Il DNA esogeno inserito nella pianta viene trascritto in RNA messaggero che a sua volta è tradotto in proteina. La pianta transgenica produrrà la proteina esogena.

metodi di trasferimento del DNA Agrobacterium tumefaciens Trasferimento diretto del DNA - sistema biolistico - trasformazione protoplasti - microiniezione Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium batterio del suolo Gram-negativo infetta numerosi generi di piante (Brassica, Lilium, Lycopersicon, Nicotiana) Agrobacterium tumefaciens induce la formazione di tumori galla del colletto Agrobacterium rhizogenes induce la formazione di radici avventizie nel sito di infezione

Il fenotipo alterato è una conseguenza della trasformazione della cellula vegetale Il batterio è in grado di trasferire DNA nella cellule vegetali, con conseguente sovrapproduzione di ormoni (auxina e citochinine) che inducono proliferazione cellulare (fenotipo tumorale)

amminoacidi prodotti dalla pianta in seguito al trasferimento, dal plasmide Ti, dei geni codificanti per gli enzimi coinvolti nella loro sintesi Agrobacterium utilizza tali sostanze come fonte di nutrimento

1 ferita  produzione acetosiringone 2 acetosiringone  adescante chemiotattico attivatore trascrizione geni Vir 3 proteine Vir  produzione T-DNA e suo targeting 4 trasferimento T-DNA 5 integrazione T-DNA 6 produzione ormoni e opine 7 formazione tumore

Agrobacterium è in grado di trasferire nel genoma vegetale qualsiasi sequenza si trovi delimitata dai right e left borders gene di interesse Si può sostituire il T-DNA endogeno con un gene di interesse, Agrobacterium lo trasferirà nella cellula vegetale

metodi di trasferimento del DNA Agrobacterium tumefaciens Trasferimento diretto del DNA - sistema biolistico - trasformazione protoplasti - microiniezione Agrobacterium rhizogenes

SISTEMA BIOLISTICO PARTICLE GUN 1987 Sanford e colleghi particelle di oro o tungsteno ricoperte di DNA vengono accelerate e “sparate” sul tessuto penetrando rilasciano il DNA che viene integrato nel genoma vegetale prima si usava polvere da sparo per l’accelerazione oggi He

L’elemento chiave che permette di trasformare la pianta è la capacità unica delle cellule vegetali di crescere, dividersi e rigenerare l’intera pianta TOTIPOTENZA Cellule vegetali private della parete cellulare (protoplasti) o parti di tessuto possono essere coltivate “in vitro”, in appropriate condizioni, in modo da formare una massa di tessuto indifferenziato noto come callo

Per la trasformazione delle piante si utilizzano piccoli espianti di tessuto foglie fusto radici gemme cotiledoni da cui verrà rigenerata la pianta attraverso la formazione del callo

SELEZIONE DELLE PIANTE TRASFORMATE nel costrutto si inserisce un gene marcatore per la selezione Resistenza ad un antibiotico Resistenza ad un erbicida nel terreno di coltura viene aggiunto l’antibiotico o l’erbicida cresceranno solo le piantine che hanno acquisito la resistenza

Struttura di un gene Promotore regione codificante regione trascritta

RNA polimerasi fattori di trascrizione La RNA polimerasi e i fattori di trascrizione si legano al promotore e trascrivono il gene producendo l’RNA messaggero

PROMARKERTERPROGENE XTER LB RB T-DNA Per l’espressione del gene di interesse non è necessario utilizzare il promotore di quello specifico gene COSTRUTTO TRANSGENICO

PROMOTORI - CaMV 35S (elevati livelli di espressione) RNA 35S del virus a mosaico del cavolfiore - Actina di riso - Ubiquitina di mais - Nos, Ocs (nopalina, octopina sintasi) - espressione regolata dallo sviluppo - indotti da luce, stress, ormoni - da sostanze chimiche Costitutivi Inducibili

Tessuto-specifici - semi - radici - foglie - polline - etc. PROMOTORI

PROMARKERTERPROGENE XTER LB RB T-DNA Nos-PNptIINos-TCaMV 35SGENE XNos-T LB RB T-DNA Nos-P promotore del gene della Nopalina sintasi NptII Neomicina fosfotransferasi (resistenza alla Kanamicina) Nos-T terminatore del gene della Nopalina sintasi CaMV 35S promotore del RNA 35S del virus a mosaico del cavolfiore

Applicazioni delle piante geneticamente modificate

Principali caratteri ingegnerizzabili TOLLERANZA A CONDIZIONI AMBIENTALI SFAVOREVOLI siccità freddo caldo RESISTENZA A INSETTI E PATOGENI virus batteri funghi MIGLIORAMENTO DELLE QUALITA’ NUTRIZIONALI contenuto di vitamine amminoacidi lipidi metaboliti secondari

altre applicazioni  produzione di vaccini  produzione di proteine di interesse  produzione di metaboliti secondari

LO STATO ATTUALE DELLE COLTIVAZIONI TRANSGENICHE NEL MONDO dati estratti da: Clive James, 2013 Global Review of Commercialized Transgenic crops. Published as ISAAA Briefs (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications)

Soia 62% delle coltivazioni GM Mais 22% Cotone11% Colza 5%

I caratteri più diffusi nelle attuali varietà GM sono:

Resistenza agli insetti

roditori nematodi acari uccelli INSETTI Gli insetti sono una delle maggiori cause di perdita del raccolto larve di: lepidotteri coleotteri ortotteri omotteri piralide del mais esempi: piralide del mais (Ostrinia nubilans, Lepidottero) dorifora della patata dorifora della patata (Leptinotarsa decemlineata, Coleottero)

Tossina Bt endotossina prodotta da Bacillus thuringiensis - Mancanza di stabilità - Bassa permeabilità nei tessuti vegetali Il pesticida “biologico” più ampiamente utilizzato da circa 50 anni 2% del mercato globale degli insetticidi nel 1995 “nemico naturale” di molti insetti Usato ampiamente contro zanzare e mosche Problemi

Modo di azione delle tossine di Bacillus thuringiensis La tossina si inserisce nella membrana delle cellule epiteliali dell’intestino creando un canale ionico Ciò determina un’alterazione dei flussi ionici e quindi la lisi delle cellule epiteliali L’insetto smette di mangiare, si disidrata e muore

Inserire il gene per la proteina Bt in piante di mais in modo che la pianta sia costantemente protetta dall’attacco degli insetti STRATEGIA Ciò permette di ridurre drasticamente l’impiego di pesticidi chimici

35S-p Hsp70 int1 Cry1A(b)nos-t mais MON810 Monsanto mais Bt

MIGLIORAMENTO DELLE QUALITA’ NUTRIZIONALI Uso dell’ingegneria genetica per migliorare: –livelli di  -carotene –contenuto di amminoacidi –contenuto di lipidi –altri - vit E, Ferro, etc.

Aumentare l’espressione di geni codificanti per enzimi della via biosintetica Possibile se la via biosintetica della molecola è nota e sono noti i geni codificanti gli enzimi coinvolti

Acido arachidonico Acido eicosapentenoico Inserendo in pianta il gene della elongasi e della desaturasi SOIA COLZA

GOLDEN RICE 200 milioni di donne e bambini sono affetti da carenza di Vitamina A ogni anno circa bambini diventano ciechi circa 2 milioni di bambini muoiono ogni anno per malattie da carenza di Vit. A Il riso brillato non contiene  -carotene  -carotene

FUNZIONI Visione Differenziamento cellule epiteliali Fertilità Cheratinizzazione Diarrea Malattie della pelle Cecità Infertilità Malattie respiratorie CARENZA VITAMINA A GOLDEN RICE

Ingo Potrykus (Svizzera) Peter Beyer (Germania) Far produrre al riso il  -carotene anche a livello dell’endosperma del seme GOLDEN RICE

RISO GOLDEN RICE

NarcisoMais GOLDEN RICE II L’enzima limitante è la fitoene sintasi (PSY) Ricerca della PSY più attiva I livelli maggiori si ottengono con la PSY di mais

GOLDEN RICE Sviluppato da istituti di ricerca pubblica, non da industrie biotec Contiene un numero elevato di brevetti, ma il suo uso sarà consentito a scopo umanitario; gli agricoltori con reddito inferiore a $ potranno usarlo e riseminarlo E’ in corso l’adattamento a varietà locali di riso dei paesi asiatici mediante breeding tradizionale presso i Centri di Ricerca di quei paesi

AZIONE Antiossidante e anti-radicali liberi Previene ossidazione acidi grassi membrana plasmatica  integrità cellule RDA UI (7-9 mg  -tocoferolo) Dosi superiori ( UI)  riduzione malattie cardiovascolari riduzione processi degenerativi 60%OLI VEGETALI 40% ALTRI ALIMENTI tocoferolo

NON TUTTI I TOCOFEROLI HANNO LA STESSA EFFICACIA Uguale assorbimento Diversa distribuzione nel corpo ATTIVITA’  -tocoferolo 100  -tocoferolo 50  -tocoferolo 10  -tocoferolo 3 Molti oli vegetali contengono alti livelli di  -tocoferolo e bassi livelli di  -tocoferolo Sovraespressione del gene della  -tocoferolometiltransferasi

 Introduzione di geni del pathway biosintetico delle antocianine  Sovraespressione di fattori di trascrizione che determinano un aumento degli enzimi biosintetici

Miglioramento delle qualità nutrizionali i semi dei cereali contengono il 15-20% di proteine basso contenuto di lisina i legumi contengono il 20-30% di proteine basso contenuto di S-amminoacidi

manipolazione delle vie biosintetiche aspartato chinasi (AK) e diidropicolinato sintasi (DHDPS) sono il punto di controllo della via biosintetica forme di aspartato chinasi e di DHDPS insensibili al feedback sono state clonate in piante di soia aumento di circa 100 volte della lisina libera nei semi

Resistenza alle malattie Batteri Funghi Virus La varietà San Marzano è particolarmente sensibile all’infezione virale. Le perdite nel raccolto possono raggiungere il 100% Virosi Non esistono trattamenti chimici normaletransgenico

Esprimono il gene codificante per la “coat protein” virale. La sovraespressione di tale gene silenzia l’espressione del gene virale impedendo la replicazione del virus PIANTE DI PAPAYA RESISTENTI AL PRSV (papaya ringspot virus) non transgenica transgenica

MATURAZIONE DEL FRUTTO

Durante il processo di maturazione, i frutti di molte specie subiscono varie modificazioni tra cui: alterazione della ultrastruttura della parete cellulare e della consistenza conversione di amido in zuccheri semplici alterazione della biosintesi e accumulo di pigmenti incremento dei livelli di composti volatili che danno sapore e aroma incremento della suscettibilità a patogeni dopo la raccolta

FLAVR SAVR Tomato 1° alimento geneticamente modificato Calgene, Inc. (Davis, CA) 1994 Il pomodoro si ammorbidisce a causa della presenza della Poligalatturonasi (PG), un enzima che degrada la pectina IDEA: mantenere il pomodoro compatto anche quando è lasciato maturare sulla pianta –Spegnere il gene per la PG –In assenza di PG --> assenza di degradazione della pectina Strategia ----> Gene PG antisenso –Generazione di piante di pomodoro transgenico con un gene PG di pomodoro orientato antisenso –Brevetto ampio in 1992 –1994 la FDA approva la vendita di FLAVR SAVR

ALTRA STRATEGIA BLOCCARE LA SINTESI DELL’ETILENE, ORMONE CHE REGOLA LA MATURAZIONE DEL FRUTTO

- ACC-sintasi anti-senso

controllo transgenicotransgenico + etilene controllo della maturazione del frutto

LE PIANTE COME BIOREATTORI

POSSIBILI PRODOTTI - Anticorpi - Proteine di interesse farmaceutico - Vaccini edibili - Metaboliti secondari - Polimeri biodegradabili

“Plantibodies” scopo diagnostico e terapeutico CaroRx CEA: glicoproteina tumorale scopo diagnostico applicazione topica previene la trasmissione del virus

VACCINI EDIBILI I vaccini attuali sono costosi Sono richieste infrastrutture per il trasporto e la somministrazione (problemi logistici ed economici) Problema per i paesi poveri

Vantaggi della produzione in piante transgeniche: Coltivazione in loco; basso costo Non è necessario personale per la somministrazione del preparato Disponibili indefinitamente (ogni anno si riseminano)

Proteine espresse in piante transgeniche con applicazioni come vaccini animali e umani

presenza del gene marcatore per la resistenza a un antibiotico possibilità di sviluppo di microrganismi resistenti (flora intestinale) resistenza agli insetti: possibilità che si sviluppino insetti resistenti flusso genico – dispersione del transgene attraverso l’ibridazione PRINCIPALI CRITICHE MOSSE AGLI OGM