PRINCIPALI OPERAZIONI UNITARIE DI CUI SI COMPONE UN PROCESSO BIOTECNOLOGICO INDUSTRIALE MATERIE PRIME REAZIONE DOWNSTREAM PROCESSING BIOCATALIZZATORE Idrolisi ottimizzazione sterilizzazione Screening Mutazione Tecniche rDNA Fusioni (hybridoma) Immobilizazione Fermentazione Catalisi enzimatica Sedimentazione Filtrazione Cristallizazione Precipitazione Estrazione Adsorbimento Cromatografiaa STABILIZZAZIONE DEL PRODOTTO E COMMERCIALIZZA- ZIONE

Che cosa determina il successo di una produzione industriale? Ricavo Valore del prodotto x quantità vendute - Costo materie prime Guadagno = Costo del processo - Prodotti ad elevato valore aggiunto! Economiche, facile reperibilità Semplicità, riproducibilità, elevata produttività* *produttivita’ = quantita’ di prodotto nell’unita’ di tempo In un processo fermentativo la formulazione del terreno di coltura e la scelta delle materie prime è di importanza strategica!! La resa/produttività del processo possono essere fortemente influenzati dalla scelta del mezzo di coltura!!

Equazione generica che descrive la stechiometria della crescita e della sintesi del prodotto in un processo aerobico fonte di Nfonte di C ed energia O2O2 altre richieste nutritive biomassaprodotto CO 2 calore H2OH2O

COME SI PROGETTA UN MEZZO DI COLTURA? oComposizione “elementare” del microrganismo da crescere!!! oInformazioni sul metabolismo dell’organismo da crescere oProfilo di acquisizione dei nutrienti e substrati

Composizione elementare di batteri, lieviti, funghi (% su peso secco ) BatteriLievitiFunghi Elemento Carbonio Ossigeno Idrogeno Azoto Fosforo Zolfo Potassio Sodio Calcio Magnesio Cloro Ferro

La reale composizione può variare molto in base alle condizioni di crescita, come la velocità di crescita, la temperatura, eventuale limitazioni di substrato, ecc.

Elementi in tracce spesso usati nella formulazione di mezzi di coltura ed esempi di loro funzioni Ca (II) Comune co-fattore per proteasi ed amilasi Fe (II) componente dell’eme (citocromo, catalasi), ferredossine and flavoproteine Mn (II) co-fattore in molti enzimi Cu (II) in peptidasi and citocrome ossidasi (S. cerevisiae) Co (II) in enzimi cobalamina-dipendenti Zn (II) co-fattore in molte peptidasi Mo (IV) co-fattore in nitrato reduttasi ELEMENTI RICHIESTI PER LA CRESCITA Macro-elementiC, O, N, H, P (alta concentrazione) (mM) Micro-elementii.e. S, Mg, K (concentrazione intermedia) (  M) Elementi in tracceComposti inorganici (bassa concentrazione)

ELEMENTI RICHIESTI PER LA CRESCITA Macro-elementiC, O, N, H, P (alta concentrazione) (mM) Micro-elementii.e. S, Mg, K (concentrazione intermedia) (  M) Elementi in tracceComposti inorganici (bassa concentrazione) Tipica soluzione stock 1 di elementi in tracce per mezzi di coltura di E. coli FeSO g/L CaCl g/L MnCl g/L ZnSO 4 7H 2 O0.2 g/L CuSO g/L CoCl g/L EDTA-Na 2) 5 g/L 1) Si aggiunge 1 ml di soluzione stock/L 2) EDTA è impiegato per prevenire la precipitazione

ELEMENTI RICHIESTI PER LA CRESCITA Macro-elementiC, O, N, H, P (alta concentrazione) (mM) Micro-elementii.e. S, Mg, K (concentrazione intermedia) (  M) Elementi in tracceComposti inorganici (bassa concentrazione) FATTORI DI CRESCITA FATTORI DI CRESCITA composti organici, es. vitamine (bassa concentrazione) Vitamine Fattori di crescita comuni per i microorganismi Acidi grassi insature Acido oleico Acido linoleico Acido linolenico Acido Nicotinico Acido pantotenico Riboflavina Tiamina Biotina Acido folico Piridossina Le specifiche richieste dipendono dal ceppo I componenti richiesti per la crescita dovrebbero essere aggiunti in concentrazioni proporzionali al loro effettivo consumo Non sono mai impiegati come fonti di C/energia!!

ELEMENTI RICHIESTI PER LA CRESCITA Macro-elementiC, O, N, H, P (alta concentrazione) (mM) Micro-elementii.e. S, Mg, K (concentrazione intermedia) (  M) Elementi in tracceComposti inorganici (bassa concentrazione) LA SOLUBILITA’ DELL’OSSIGENO E’ MOLTO SCARSA 7 mg/L L’OSSIGENO RICHIESTO DURANTE I PROCESSI AEROBICI E’ FORNITO MEDIANTE AEREAZIONE CONTINUA FATTORI DI CRESCITA FATTORI DI CRESCITA composti organici, es. vitamine (bassa concentrazione)

MEZZO DEFINITO Miscela di sostanze chimiche a composizione nota MEZZO COMPLESSO Miscela di sostanze chimiche a composizione incognita in quanto derivante da idrolisi di cereali, carne, lievito MEZZO MINIMO Mezzo definito che però contiene il minimo dei componenti richiesti per la crescita

Raw materials for industrial microbial fermentation processes C/energy sourcesN-sourcesVitamin sources Sucrose Glucose Lactose Starch syrup Starch (corn-, potato) Malt extract Grains Molasses (cane-, beet) Whey Methanol Hydrocarbons Ligno-cellulosic materials Ammonia Ammonium Sulphate Ammonium nitrate Corn steep liquor Pharmamedia Soy meal Fish meal Peanut meal Whey Distillers soluble Peptones of casein, Soy, fish, meat Yeast extract Distillers soluble Whey Gli scarti di industrie alimentari come componenti dei terreni di coltura industriali Pro: - ottimo materiale di partenza per la crescita microbica (contengono ancora molti nutrienti) - molto economici Contro: - composizione variabile - necessitano spesso l’aggiunta di additivi

Facciamo un esempio….

L’importanza della formulazione del terreno di coltura nelle fermentazioni industriali Il lievito S. cerevisiae può essere validamente utilizzato per almeno due processi rilevanti dal punto di vista industriale : Produzione di bioetanolo (conversione di zuccheri fermentabili in EtOH) FERMENTAZIONE Produzione di lievito per la panificazione (biomassa) RESPIRAZIONE E’ possibile condurre entrambi i processi in terreni di coltura realizzati con i medesimi componenti! ( es. melasse, ammonio, vitamine ) Ma la esatta formulazione del mezzo di coltura industriale deve essere profondamente diversa e le condizioni operative controllate E’ possibile condurre entrambi i processi in terreni di coltura realizzati con i medesimi componenti! ( es. melasse, ammonio, vitamine ) Ma la esatta formulazione del mezzo di coltura industriale deve essere profondamente diversa e le condizioni operative controllate

Che cosa determina la scelta del tipo di metabolismo svolto dalle cellule di S. cerevisiae? S. cerevisiae è caratterizzato dall’effetto Crabtree, cioè l’inibizione della respirazione in elevate concentrazioni di glucosio Intrinseche limitate capacità respiratorie Repressione da cataboliti del glucosio

Effetto della concentrazione di glucosio sui parametri della crescita di S. cerevisiae S. cerevisiae è caratterizzato dall’effetto Crabtree, cioè l’inibizione della respirazione in elevate concentrazioni di glucosio Andamento dei principali parametri di crescita del lievito in funzione della [glucosio] S crit = 50mg/l Il metabolismo respirativo è attivo a [glucosio] < S crit Per ottenere biomassa è necessario controllare la [glucosio] in FED-BATCH Il metabolismo fermentativo è attivo a [glucosio] > S crit Per ottenere etanolo la [glucosio] deve essere mantenuta alta

Metodiche innovative per la ottimizzazione della formulazione dei terreni di coltura industriali In un processo fermentativo è frequente osservare interazioni combinatoriali tra componenti del mezzo, metabolismo cellulare e produzione del composto in oggetto!! L’approccio empirico alla ottimizzazione della formulazione (full factorial search) non è il migliore perché non può “prevedere” l’interazione/ interferenza tra singoli componenti! Metodi statistici alla ottimizzazione della composizione dei terreni di coltura Fractional factorial search Responce surface methodology

Full factorial search Prove in cui una variabile indipendente (concentrazione di nutriente, pH, temperatura ecc..) viene fatta variare mentre si lasciano costanti gli altri parametri, quindi la procedura va ripetuta per tutte le variabili Numero di prove= x n x è il numero di livelli (valore che si vuole valutare per ogni variabile) n è il numero dei variabili da considerare

Full factorial search Numero di prove= x n Tre nutrienti a due concentrazioni: 2 3= 8 prove Sei nutrienti a tre concentrazioni : 3 6 =729 prove !!!!!!!!! esponenziale!!!!!!! Il numero di combinazioni aumenta all’aumentare delle variabili in maniera esponenziale!!!!!!!

Fractional Factorial design: Il metodo statistico di Plackett-Burman In questo metodo:  É possibile studiare l’effetto principale (lineare) di ogni variabile con un numero limitato di prove (una frazione di quelle possibili)  Si assume che le variabili non agiscano sinergicamente tra di loro  Si utilizza una matrice con precise caratteristiche (la matrice di Hadamard) per descrivere il numero minimo di esperimenti da effettuare

X = Fractional Factorial design: Il metodo statistico di Plackett-Burman La matrice di Hadamard è una matrice di 1 e a-1 in cui le colonne sono ortogonali Il principio con il quale è costruita la matrice e è quello di effettuare delle prove che descrivano al meglio l’intero spazio delle possibili prove, ovvero gli esperimenti sono scelti in modo da stimare, tra le possibili condizioni, quelle più distanti.

Fractional Factorial design: Il metodo statistico di Plackett-Burman Nella matrice degli esperimenti sulle colonne sono indicate le variabili da valutare e sulle righe gli esperimenti da effettuare, i valori che assumono le variabili sono solitamente due e indicano due possibili concentrazioni del componente

solo nel caso in cui non ci siano interazioni fra le variabili generatori di matrici Il metodo di Plackett-Burman consente di studiare l’effetto principale di ogni variabile con un ridotto numero di esperimenti solo nel caso in cui non ci siano interazioni fra le variabili, poiché nella realtà molto spesso ci sono effetti sinergici fra i componenti di un mezzo di coltura sono stati sviluppati dei generatori di matrici che consentono di costruire matrici, e quindi pianificare esperimenti, che tengano conto anche di questo effetto. Fractional Factorial design

scelta la matrice Una volta scelta la matrice più adatta si effettuano gli esperimenti indicati dalle righe della matrice registrano i valorisi registrano i valori della quantità da ottimizzare ottenuti per ogni esperimento valutare l’effettobisogna valutare l’effetto di ogni singolo componente sul risultato. “significativi” un’interpolazione Per avere idea di quali composti sono “significativi” si fa un’interpolazione, lineare e/o quadratica, dei valori della quantità da ottimizzare ottenuti Fractional Factorial design: interpretazione dei risultati

Interpretazione dei risultati i valori di tali coefficienti l’informazione sull’influenza componenti sono critiche Le funzioni scelte per l’interpolazione (tecnica di regressione multipla, lineare o quadratica) sono funzioni parametriche che hanno come parametri i coefficienti di peso delle variabili; dall’interpolazione si ottengono i valori di tali coefficienti che forniscono l’informazione sull’influenza delle diverse variabili sul risultato, consentendo di stabilire quali componenti sono critiche nella formulazione del terreno. Y=b 0  b i x i  b ii x i 2  b ij x i x j

concentrazione ottimale Una volta individuati i componenti “critici” grazie al fractional factorial design in molti lavori recenti si fa seguire la determinazione della concentrazione ottimale di ogni componente chiave individuato. Responce Surface Methodology (RSM). prevedere Questa ottimizzazione si può ottenere usando un'altra tecnica chiamata Responce Surface Methodology (RSM). Questo metodo statistico, dopo aver progettato una nuova serie di esperimenti (design)e aver ottenuto i rispettivi risultati, permette di costruire un modello dal quale è possibile prevedere in che condizioni si ottiene il risultato migliore Responce Surface Methodology (RSM)

modello carta topografica Semplificando al caso di due sole variabili è possibile descrivere il modello ottenuto con la tecnica RSM come una carta topografica in cui le superfici racchiuse da una curva invece di indicare punti alla stessa altitudine indicano i casi in cui, al variare delle due variabili in esame, si ottiene lo stesso valore del parametro da ottimizzare (biomassa, produzione di un metabolita ecc..).

Responce Surface Methodology (RSM) La tecnica può essere applicata a diversi livelli di sofisticazione, nel caso più semplice per delineare la ”superficie di risposta” migliore si parte dallo spazio descritto delle due variabili da analizzare, in questo spazio si fanno n esperimenti e ottenuti i risultati si restringe lo spazio alla zone che contiene l’esperimento (il punto) con il risultato migliore, quindi si ripete l’operazione nel nuovo spazio finché la differenza fra il risultato migliore del ciclo precedente e quello ottenuto con il ciclo in corso è trascurabile.

Responce Surface Methodology (RSM) sofisticate modelli matematici Applicazioni più sofisticate della tecnica RSM usano modelli matematici per: analizzare analizzare i dati sperimentali costruire costruire il modello prevedere prevedere le relazioni tra il risultato e i valori assunti dalle variabili.

Metodi statistici: un esempio Questo insieme di tecniche statistiche 1.per la progettazione di esperimenti 2.la costruzione dei modelli 3.la valutazione degli effetti dei vari fattori 4.la ricerca delle condizioni ottimali ha consentito l’ottenimento della formulazione migliore in moltissimi casi, anche nel caso di fermentazioni finalizzate a prodotti completamente diversi come proteine ricombinanti antibiotici o biomassa.