EQUAZIONI DIFFERENZIALI  Funzioni che mettono in relazione una variabile indipendente (es. x), una sua funzione ( es. y = f(x) ) e la derivata di quest’ultima ( es. y’ = f’ (x) ).  Ordine: massimo grado di derivazione che compare nell’equazione differenziale. ESEMPIO SOLUZIONI Generale Ogni equazione differenziale ha infinite soluzioni che differiscono per una costante. Particolare Si ottiene applicando la condizione iniziale alla soluzione generale trovata

VELOCITÀ DI REAZIONE Il procedere di una reazione può essere seguito misurando l’ammontare di sostanza di un componente (reagente o prodotto) in tempi successivi Per velocità di reazione si intende la variazione dell’ammontare di sostanza nell’unità di tempo Nella maggior parte dei casi è conveniente riferire la velocità di reazione a variazioni di concentrazioni La velocità di reazione riferita alla concentrazione C di un reagente è data dal valore assoluto della derivata della concentrazione rispetto al tempo

Per una generica reazione La velocità di reazione si scrive

EFFETTO DELLA CONCENTRAZIONE Consideriamo la reazione omogenea di decomposizione termica del pentossido di azoto Riportando in grafico la velocità della reazione (come variazione della concentrazione del pentossido nel tempo) in funzione del tempo si ottiene una retta, quindi La velocità di decomposizione è proporzionale alla concentrazione di quindi Una reazione che segue una legge di questo tipo viene detta reazione del primo ordine e la costante di proporzionalità è detta costante di velocità o velocità specifica del primo ordine. Le dimensioni di k sono tempo -1

REAZIONI DEL PRIMO ORDINE Occorre trovare una relazione tra le concentrazioni e il tempo Supponiamo che la reazione Aprodotti segua una cinetica del primo ordine ricordando la definizione di velocità di reazione: Possiamo scrivere Questa espressione viene chiamata legge cinetica differenziale. Per ottenere un’espressione in cui la dipendenza della concentrazione di A dal tempo sia esplicita è necessario integrare la legge differenziale. Riarrangiando l’equazione precedente, otteniamo

Integrando si ha Quindi se riportiamo in grafico in funzione del tempo otteniamo una linea retta la cui pendenza è uguale a e la cui intercetta all’origine corrisponde a il logaritmo naturale della concentrazione iniziale È la concentrazione iniziale cioè al tempo ponendo quindi si ha Cioè in una reazione del primo ordine il logaritmo naturale della concentrazione è funzione lineare del tempo

MAIN UNIT OPERATIONS AND UNIT PROCESSES OF INDUSTRIAL BIOTECHNOLOGY RAW MATERIALS REACTION DOWNSTREAM PROCESSING BIOCATALIST Hydrolysis Optimization Sterilization Screening Mutation rDNA techniques Fusion (hybridoma) Immobilization Fermentation Enzymatic catalysis Sedimentation Filtration Crystallization Precipitation Extraction Adsorption Chromatography PRODOTTOPRODOTTO

Reazioni intracellulari Substrati Prodotti del metabolismo Macromolecole extracellulari Biomassa

Un biotecnologo mira ad usare i sistemi biologici per massimizzare i profitti e ottimizzare l'efficienza di utilizzazione delle risorse. Per realizzare questo obiettivo, i sistemi cellulari devono essere descritti quantitativamente. Ovvero è necessario conoscere la cinetica del processo poiché solo determinando la cinetica del sistema è possibile predire le rese ed i tempi di reazione e consentire così corretta progettazione del processo di produzione.

DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO lo scopo della modellazione –predizione –ottimizzazione –controllo di processo Occorre costruire un modello matematico del sistema reale. Esso non è altro che un insieme di equazioni, più o meno complesse, che legano tra loro le grandezze che influenzano l’evoluzione del sistema stesso. Normalmente, nello studio di un sistema reale, si individuano alcune variabili considerate come dati d’ingresso dello studio, eventuali parametri costanti ed alcune variabili di uscita; queste ultime sono le grandezze che si vogliono osservare al variare dei dati di ingresso. Le equazioni di un modello sono, quindi, relazioni funzionali tra le grandezze di ingresso e di uscita. Le relazioni sono espresse sotto forma di equazioni matematiche, in dettaglio i modelli sono descritti da equazioni differenziali.

Tappe della descrizione quantitativa di un processo fermentativo Descrivere la cinetica del processo, descrivendo le velocità delle reazioni cellulari come funzioni delle variabili attraverso espressioni matematiche Descrivere il bilancio di massa, specificando come questo parametro varia nel tempo e cosa entra o esce dal reattore Definire la complessità del modello, definendo il numero di reazioni da considerare e la loro stechiometria Valutazione dell’adattamento del modello ai dati sperimentali DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO

Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X[g L -1 ] Peso secco della biomassa N[nL -1 ] Numero di Cellule S[g L -1 ] Substrato P[g L -1 ] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

DIFFERENTI TIPI DI MODELLI DI CINETICA DI CRESCITA MICROBICA Caratteristiche Tutte le reazioni sono descritte come una unica reazione funzione di una singola variabile Non strutturati Strutturati Vengono considerate specifiche reazioni intracelluari e quindi la velocità di rezione è funzione di più parametri Non- segregato Segregato Tutte le cellule sono simili La popolazione contiene cellule con differenti caratteristiche q S q P q S2 q P2 q S q bP q ab a b a b a b

Noi useremo MODELLI DELLA CINETICA DI CRESCITA MICROBICA NON-SEGREGATI e NON–STRUTTURATI NON-SEGREGATI: si assume che tutte le cellule siano simili Cioè hanno tutte la stessa “età”, lo stesso numero di copie di plasmide, la stessa dimensione, la stessa morfologia…… NON–STRUTTURATI: si assume che la velocità di reazione non sia influenzata dalla struttura intra-cellulare, cioè si assume che la struttura intra-cellulare rimanga sempre la stessa Modello della cellula come scatola nera

La crescita dei microrganismi è condotta in specifici contenitori chiamati bioreattori che costituiscono l’ ambiente controllato in cui si allestisce il processo fermentativo. Esistono tre principali modalità con cui è possibile condurre una fermentazione: batch, continuo e fed batch

Fermentazione discontinua o Batch La coltura batch può essere vista come un’estensione volumetrica di una coltura in provetta o in beuta ed ha una durata temporale definita poiché costituisce un sistema chiuso che contiene un limitato ammontare di nutrienti. Fase lag o fase di latenza Fase log o fase logaritmica Fase stazionaria Fase di declino o morte

Fermentazione discontinua o Batch In fase esponenziale non solo la concentrazione cellulare aumenta ma lo fa in maniera esponenziale. Avviene un processo definito auto-catalitico in cui, se gli altri parametri restano costanti, la velocità di aumento della biomassa (cellule) dipende dalla concentrazione di cellule presenti nel bioreattore Where X is the concentration of biomass in the bioreactor. Biomass concentrations are typically expressed in g/l µ = Velocità specifica di crescita [kgkg -1 h -1 ] Rappresenta la velocità di incremento di biomassa per unità di massa di cellule. Descrive l’evoluzione della coltura nel tempo.

se µ è costante integrando si ha Nel caso di una crescita bilanciata ovvero con Incremento ordinato di tutti i componenti chimici della cellula di organismi che si moltiplicano per fissione binaria. Queste relazioni sono valide solo nella fase di crescita definita appunto esponenziale Descrive lo sviluppo in uno stadio qualsiasi della crescita cellulare.

SVILUPPO DEI BATTERI idratazione duplicazione del materiale genetico formazione del setto separazione delle cellule 1 cellula iniziale 2 cellule nuove

SVILUPPO DEI LIEVITI TEMPO MEDIO DI GEMMAZIONE: 1,5 h accrescimento della gemma produzione di una gemma unica

CRESCITA ESPONENZIALE DEI BATTERI 20 ‘ 40 ‘ 60 ‘ Con un tempo di duplicazione di 20’, dopo 5 ore da 1 batterio se ne formeranno ben ! …. e così via, finchè i batteri trovano sufficiente nutrimento

Espressione matematica della crescita microbica in funzione del numero di cellule n = numero di generazioni o numero totale di duplicazioni t d = tempo di generazione o di duplicazione Al tempo t: ln N ln N 0 t CRESCITA MICROBICA Crescita di una popolazione di microrganismi in determinate condizioni colturali = aumento del numero di cellule in un dato Δt

Al tempo t Velocità di sviluppo caratteristica di ciascun microrganismo in una data condizione t d il tempo di duplicazione è caratteristico di ciascun microrganismo in un dato ambiente di sviluppo. In fase esponenziale questo valore si può considerare costante

Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X[g L -1 ] Peso secco della biomassa N[nL -1 ] Numero di Cellule S[g L -1 ] Substrato P[g L -1 ] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH DURANTE UN PROCESSO IN BATCH, LA VARIAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DI BIOMASSA (O DEL NUMERO DI CELLULE) NELL’UNITA’ DI TEMPO DIPENDE DALLA BIOMASSA STESSA X (NUMERO DI CELLULE N) E DALLA VELOCITA’ SPECIFICA DI CRESCITA IN QUELLE CONDIZIONI µ µ = Velocità specifica di crescita [kgkg -1 h -1 ], Descrive l’evoluzione della coltura nel tempo

Come varia µ durante la crescita batch Time Specific growth rate µ [h -1 ] ABCDEF ABCDEF In fase lag e in fase stazionaria In fase esponenziale

Anche nelle migliori condizioni colturali una certa quota della popolazione microbica va incontro a morte con una certa velocità   quindi la massa microbica presente ad un qualunque tempo t dovrà essere decurtata di un certo fattore di correzione Questo fattore è trascurabile in fase log in cui  ma in fase stazionaria diviene rilevante poiché  ≥  CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH

µ la velocità specifica di crescita µ T pH S ecc… dove s1, s2..., sn sono le concentrazioni dei singoli componenti del substrato S, T la temperatura ed i l'azione di inibitori, mentre tra parentesi quadre vengono indicate le attività di ioni o molecole presenti

Valore del pH - acidofili - alcalofili - mesofili  pH alcalinità acidità FATTORI CHE INFLUENZANO LO SVILUPPO 7

Temperatura  aumento di T psicrofilimesofilitermofili FATTORI CHE INFLUENZANO LO SVILUPPO

Sebbene  sia legata ad una serie di variabili in un bioreattore queste possono essere mantenute tutte costanti tranne la concentrazione di un unico componente S del substrato. Pertanto, se ipotizziamo di mantenere costanti tutte le altre variabili, il valore istantaneo di  può essere legato esclusivamente all’unico componente essenziale S dalla relazione V X, S Schema reattore batch Il consumo di un componente del substrato essenziale allo sviluppo S fa si che la sua concentrazione prima sufficiente divenga limitante per la crescita cellulare. CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH Rapporto tra la concentrazione del substrato e la velocità di sviluppo

 conc. del componente s  max s0s0 s X non limitante (sufficiente) limitante decremento nel tempo del componente “s” componente “s” CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH Rapporto tra la concentrazione del substrato e la velocità di sviluppo

CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH Rapporto tra la concentrazione del substrato e la velocità di sviluppo In un processo batch il valore di  varia in maniera continua da un minimo, corrispondente a quello del metabolismo basale della biomassa in fase lag e stazionaria, ad un massimo che si osserva per buona parte della fase log. Nel 1942 Jaques Monod propose la seguente relazione matematica per descrivere l’effetto della concentrazione di S (SUBSTRATO LIMITANTE) sul valore di  Equazione di Monod

KSKS μ [g/gh] μ max CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH Il modello di Monod  è la velocità di sviluppo osservata  max è la velocità massima nelle condizioni di coltura S è la concentrazione del substrato limitante K S è la costante di affinità, ossia la concentrazione del substrato limitante alla quale il valore di  è la metà della massima. Rappresenta quindi un indice dell’efficienza con cui un microrganismo riesce ad utilizzare il substrato I valori di µ max e Ks dipendono dal l’organismo, il substrato limitante, il terreno di coltura, condizioni ambientali quali pH e temperatura. Il range di valori per µ max è tra 0.01 e 3 h-1. La costante di Monod assume tipicamente valori al di sotto di 0.1 gL -1.

 conc. del componente s  max s0s0 s   m ks k1sk1s k2sk2s non limitante (sufficiente) limitante decremento nel tempo del componente “s”   =  max S Ks + S componente “s” CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH Il modello di Monod

L’equazione di Michaelis Menten è stata ottenuta utilizzando come presupposto il meccanismo molecolare con cui agisce l’enzima, si parla in questo caso di modello meccanicistico. Il modello di Monod invece è stato adottato perché descrive un andamento che coincide con quello ottenuto sperimentalmente in questo caso si parla di modello empirico. Michaelis Menten Monod Model CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH Il modello di Monod

CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH La resa del processo La resa di un processo batch è il rapporto tra il substrato utilizzato e la biomassa (o un dato prodotto) ottenuti durante il processo. La resa può essere calcolata solo alla fine del processo quantificando i prodotti e rapportandoli al substrato utilizzato. La bioconversione può essere quantificata utilizzando il coefficiente di resa Y (è la media delle rese delle varie fasi del processo) che indica la quantità di cellule o di prodotto ottenuti per peso unitario di substrato utilizzato. X 0 and S 0 are the initial concentration of biomass and substrate concentrations X 1 and S 1 are the respective biomass and substrate concentration at the end of the fermentation where P 0 and P 1 are the initial and final product concentrations. I coefficienti di resa Y sono usati per la modellazione del processo fermentativo

QUANDO LA COLTURA RAGGIUNGE IL SUO MASSIMO Esprime in termini quantitativi il fabbisogno nutrizionale Y X/S Y X/S è coefficiente di resa di biomassa per substrato consumato [g g -1 ] in un intervallo di tempo definito Δt CINETICA DI CRESCITA CELLULARE IN BATCH La resa del processo In batch le concentrazioni di biomassa X e di prodotto P sono proporzionali alla concentrazione iniziale del substrato S. Questo spiega perché per ottenere più prodotto si tende ad incrementare la concentrazione del substrato iniziale

Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X[g L -1 ] Peso secco della biomassa N[nL -1 ] Numero di Cellule S[g L -1 ] Substrato P[g L -1 ] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

LA CINETICA DI FORMAZIONE DEL PRODOTTO IN BATCH poichè o Nel caso di prodotti associati alla crescita sostituendo si ha che…

SE IL PRODOTTO E’ GROWTH LINKED q P è proporzionale a µ Più IN GENERALE Se il prodotto è GROWTH-LINKED  =0 Se il prodotto è UNLINKED α =0 q P =  LA CINETICA DI FORMAZIONE DEL PRODOTTO IN BATCH Nel caso in cui il prodotto non è associato alla crescita la q p dipende dalla biomassa ma solo nella fase della crescita in cui c’è sintesi del prodotto.

Definire espressioni che descrivono come la concentrazione dei componenti (Y variabili di stato) X[g L -1 ] Peso secco della biomassa N[nL -1 ] Numero di Cellule S[g L -1 ] Substrato P[g L -1 ] Prodotto Variano con le condizioni del processo Variano nel tempo: cinetica del processo DESCRIZIONE QUANTITATIVA DEL PROCESSO FERMENTATIVO Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato

CINETICA DI CONSUMO DEL SUBSTRATO IN BATCH La concentrazione del substrato S cambierà nel tempo, ossia tenderà comunque a diminuire, secondo un'equazione generale del tipo FS 0 /V l’ingresso di substrato fresco e –FS/V l’uscita di substrato parzialmente consumato dal reattore. Entrambi i termini in un processo batch sono pari a zero. Concentrazione substrato  substrato IN  substrato per la crescita  substrato per il prodotto  substrato per il mantenimento  substrato OUT RICORDANDO CHE

Dividendo per X Da cui 1/XdS/dt indica la velocità specifica di consumo del substrato CINETICA DI CONSUMO DEL SUBSTRATO IN BATCH

Nel caso che il substrato venga utilizzato, oltre che per il mantenimento, solo per la sintesi della biomassa la velocità specifica di consumo q s sarà espressa da q s è proporzionale alla velocità di sviluppo , alla sintesi del prodotto q p ed al metabolismo basale della biomassa m. CINETICA DI CONSUMO DEL SUBSTRATO IN BATCH

Coefficiente che tiene conto del consumo di S non associato ne alla sintesi di biomassa ne alla sintesi del prodotto. Il mantenimento è necessario a mantenere gradienti di concentrazione attraverso la membrana cellulare, sostituire proteine ed altri componenti che sono degradati, sostenere processi che non supportano la crescita ma prevengono la morte. x Il mantenimento è tipicamente 1-10% di q s,ma x ; ma può essere più alto in cellule stressate: poiché il mantenimento è in parte usato per mantenere gradienti di concentrazione ambienti estremi rispetto a concentrazione salina, pH e temperatura determinano un aumento del mantenimento e una riduzione del coefficiente di resa CINETICA DI CONSUMO DEL SUBSTRATO IN BATCH COEFFICIENTE DI MANTENIMENTO m (kg kg-1 h-1)

Produttività nel processo batch Con il termine di produzione si indica la quantità di biomassa o di prodotti ottenuti alla fine del processo. La produzione totale si limita a quantificare il prodotto P ottenuto alla fine del processo senza tener conto del tempo impiegato per ottenerlo e può essere espressa in g. La produttività specifica q p corrisponde alla velocità di produzione del prodotto/o biomassa e viene calcolata come g di P o di cellule su h. La produttività volumetrica Q è la concentrazione delle cellule o di P per volume unitario e per unità di tempo ed è espressa in g/l h X max è il massimo della concentazione cellulare raggiunto durante la fermentazione X 0 è la concentrazione iniziale all’inoculo t i è il tempo in cui il microrganismo cresce con velocità massima  max t ii è il tempo in cui il microrganismo non cresce a  max (fase lag, stazionaria, tempo di sterilizzazione…)

PRODUTTIVITA’ DI UN PROCESSO BATCH conc. X tempo svuotamento puliziariempimento 2^ sterilizzazione contr. sterilità Produttività in biomassa X produttività in prodotto P conc. P 1^sterilizzazione produttività di X produttività effettiva di X produttività effettiva di P produttività di P PmPm

- la velocità specifica di sviluppo della biomassa X, - la velocità specifica di sintesi del prodotto P - la velocità specifica di utilizzazione del substrato S Modello batch

Descrivere la cinetica della crescita microbica Descrivere la cinetica della formazione del prodotto Descrivere la cinetica del consumo del substrato Produzione associata alla crescita Assumendo sia valido il modello di Monod

Rate Expression for Growth (1) Yield Expression (2) Substituting into Eq. 1 for S from Eq 2: Integrating Logistic Equation Describes Sigmoidal shape batch growth curve