preservation Servizio PMA cryo U.O. Ostetricia e Ginecologia Maria Elena Vento preservation Servizio PMA U.O. Ostetricia e Ginecologia Azienda Ospedaliera “Cannizzaro”

LA PRIMA BAMBINA NATA DA FECONDAZIONE IN VITRO Il 25 Luglio 1978 nasce in Inghilterra Louise Brown

ASSISTED REPRODUCTIVE TECHNOLOGIES m. vento

ICSI m. vento

Le prime divisioni cellulari

Courtesy by Sathananthan

MATURITA’ NUCLEARE m. vento

FECONDAZIONE Courtesy by O’ Day

FECONDAZIONE aumento intracellulare del calcio esocitosi dei granuli corticali modificazione della Z.P. e blocco alla polispermia

CARATTERISTICHE DELL’OVOCITA sensibilità alle variazioni ambientali del calcio intracellulare cromosomi esposti (fuso meiotico) sensibilità del citoscheletro alle modificazioni della temperatura

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE VESCICOLE GERMINALI Metafase II METAFASE I

la sospensione di tutte le reazioni OBIETTIVO DELLA CRIOBIOLOGIA la sospensione di tutte le reazioni biochimiche, metaboliche in modo da produrre uno stato di“QUIESCENZA” m. vento

I processi vitali sono la conseguenza di reazioni biochimiche che avvengono grazie ai movimenti molecolari in H2O CRIOBIOLOGIA Con la crioconservazione si crea uno stato di “vita sospesa” che consente la conservazione delle cellule. Una volta che il sistema biologico viene riportato a T ambiente si ha la ripresa degli scambi molecolari senza che si verifichino danni cellulari. m. vento

CRIOBIOLOGIA Cosa succede ad una cellula quando è sottoposta ad un abbassamento della temperatura?      Quali possono essere i danni provocati dalla procedura? m. vento

* CRIOBIOLOGIA H2O -5°C < t < -15°C t inferiori Aumento dei soluti H2O m. vento

* CRIOBIOLOGIA m. vento

CRIOBIOLOGIA raffreddamento troppo rapido : formazione di cristalli intracellulare raffreddamento troppo lento : eccessiva disidratazione, precipitazione dei soluti, “shrinkage” m. vento

CRIOBIOLOGIA Formazione di cristalli di ghiaccio intracitoplasmatici che aumentando il volume della cellula causano danni irreparabili alle strutture interne. Danni che si verificano da cambiamenti di temperatura al di sotto del punto di congelamento (“COLD SCHOCK”) m. vento

CRIOBIOLOGIA Per molti tipi cellulari non è possibile conciliare entrambe le esigenze senza aggiungere al mezzo di congelamento particolari sostanze definite crioprotettori Sono sostanze in grado di migliorare la sopravvivenza delle cellule sia nella fase di congelamento che in quella di scongelamento m. vento

STRATEGIE PER MIGLIORARE LA SOPRAVVIVENZA DELLE CELLULE uso dei crioprotettori “Seeding” uso dei congelatori biologici programmabili modulazione della velocita’ di scongelamento m. vento

CRIOPROTETTORI Intracellulari GLICEROLO DMSO 1.2 PROH Molecole di piccole dimensioni la cui diffusione regolata dai gruppi lipofili Extracellulari SACCAROSIO GLUCOSIO ROSSO D’UOVO LIPOPROTEINE Molecole di maggiori dimensioni che non si diffondono passivamente attraverso la membrana m. vento

CRIOBIOLOGIA sucrose PrOH * H2O m. vento

CRIOPROTETTORI Meccanismo d’azione : Abbassano il punto di congelamento della soluzione permettendo una maggiore disidratazione delle cellule duranti la procedura di congelamento Proteggono le membrane cellulari interagendo con esse durante il raffreddamento e modificandone lo stato fisico da fluido a “parzialmente rigido” m. vento

CRIOPROTETTORI CITOTOSSICITA’ Sono sostanze ad alto potere citotossico in relazione alla dose e al tempo di esposizione. m. vento

CRIOBIOLOGIA * seeding

CRIOPROTETTORI SCONGELAMENTO Deve essere rimosso gradualmente dalla cellula e per minimizzare lo shock osmotico si aggiunge alla soluzione di congelamento una sostanza non penetrante come il saccarosio che, agendo come pompa osmotica regola l’afflusso d’H2O all’interno della cellula m. vento

CRIOBIOLOGIA La curva ottimale di congelamento è specifica per ogni tipo cellulare contenuto intracellulare di H2O permeabilità di membrana rapporto superficie / volume m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE INDICAZIONI La crioconservazione del gamete femminile e/o del tessuto ovarico rappresenta un metodo per preservare la fertilità in giovani donne affette da alcune patologie il cui intervento medicamentoso rischia di compromettere definitivamente il loro patrimonio gonadico. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE INDICAZIONI Un esempio è rappresentato da giovani pazienti affette da neoplasie a carico del sistema emopoietico (morbo di Hodking), carcinoma della cervice dell'utero, della mammella, del colon, della tiroide e del fegato. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE INDICAZIONI Questa strategia può essere anche applicata a giovani donne affette da malattie infiammatorie ad eziologia autoimmune come l'artrite reumatoide, il Lupus, e da malattie infiammatorie idiopatiche intestinali, o predisposte alla POF. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE INDICAZIONI Il congelamento degli ovociti umani può essere considerato un trattamento aggiuntivo per la cura dell'infertilità perché consente il superamento di problematiche etiche e religiose legate alla crioconservazione degli embrioni. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE INDICAZIONI …può evitare i problemi legati alla sindrome da iperstimolazione ovarica evitando ulteriori stimolazioni ormonali in caso di mancato ottenimento della gravidanza al primo tentativo. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Chen 1986 Chen 1988 m. vento ?

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE PRINCIPALI PROBLEMI RISCONTRATI ALLO SCONGELAMENTO un gran numero di poliploidie numerose ritenzioni del secondo globulo polare danni ai granuli corticali m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE PRINCIPALI PROBLEMI RISCONTRATI ALLO SCONGELAMENTO CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE m. vento L’appropriata organizzazione dei microtubuli del fuso meiotico è essenziale per il corretto allineamento e per la segregazione dei cromosomi quando si ripristinano valori ottimali di temperatura La distruzione dell’architettura del citoscheletro può inoltre condurre alla ritenzione del secondo polar body o influenzare l’ingresso o la fuoriuscita di molecole e organelli. L’aumento delle aneuploidie è legato ad errori nella separazione dei cromatidi durante l’estrusione del secondo polar body

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE DANNI SUBLETALI mitocondri granuli corticali fratture z. p. citoplasma microtubuli ? Sathananthan et al (1987;1988) m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE DANNI SUBLETALI Shaw JM et al.(2000)

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE DANNI SUBLETALI osservazione dello spindle mediante PolScope Non fornisce informazioni dettagliate circa l’organizzazione dello spindle ma rappresenta comunque un metodo efficace e per nulla invasivo per determinare la sua presenza Rienzi et al.2004

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE DANNI SUBLETALI Esistono diverse teorie per spiegare il danno cellulare durante il raffreddamento lento (effetti di soluzione). Ad elevate concentrazioni saline e basse temperature le proteine si denaturano ed agiscono come riserve di ioni. Quando la cellula viene riportata a temperature fisiologiche, gli ioni in eccesso vengono liberati e provocano effetti osmotici letali.

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Metodiche di congelamento slow freezing vitrificazione Metodiche di scongelamento rapido m. vento

CRIOCONSEVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE VITRIFICAZIONE Si basa sul concetto fisico della solidificazione senza cristallizzazione di una soluzione ad elevata viscosità Alte concentrazioni di crioprotettori possono evitare totalmente la formazione di ghiaccio. Ma una vitrificazione stabile richiede elevate concentrazioni di crioprotettori (fino a 7.5M) che risultano estremamente tossiche. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE VITRIFICAZIONE vantaggi: procedura più rapida del convenzionale slow freezing non richiede seeding non richiede congelatori programmabili evita la formazione di cristalli di ghiaccio m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Survival rates Yoon 2000 V Borini 2004 Tucker 1998 Gook 1994 Al – Hasani 1987 Author 90 737 311 134 159 N° ovociti 63 37 24 41 33.9 % survived m. vento

CRIOCONSErVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE 75 159 Chen 2005 S 68.6 474 Yoon 2003 70.9 158 Yang 2002 V 82 224 Fabbri 2001 S 54 1502 Porcu 2000 % survived N° ovociti Author CRIOCONSErVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Survival rates m. vento

RISULTATI CLINICI La % di fertilizzazione degli ovociti dopo scongelamento riportata in letteratura è molto variabile Fertilizzazione Le recenti esperienze (Yoon 2003; Fabbri 2001) che hanno condotto ad un aumento della percentuale di sopravvivenza riferiscono un miglioramento anche nella % di fertilizzazione (67% e > 80%) m. vento

RISULTATI CLINICI La letteratura non fornisce dati rivelanti la qualità degli embrioni ottenuti dal punto di vista morfologico Qualità Embrionaria m. vento

RISULTATI CLINICI % Impianto Soltanto circa 100 bambini sono nati con il congelamento degli ovociti e tale valore riferito alla percentuale di ovociti sottoposti a scongelamento è realmente molto basso. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE richiede elevate concentrazioni di crioprotettori (fino a 7.5M) che risultano estremamente tossiche CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE VITRIFICAZIONE svantaggi: m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO Oggi la crioconservazione del tessuto ovarico rappresenta una delle strategie più ambiziose nel tentativo di preservare la fertilità in donne con patologie (prevalentemente oncologiche) in grado di compromettere la riserva follicolare ovarica e le possibilità riproduttive. La crioconservazione di frammenti ovarici e' applicabile anche nel caso di pazienti in età pediatrica, non presuppone alcuna stimolazione ormonale dell'ovaio e da una biopsia ovarica è possibile ottenere centinaia di follicoli primordiali contenenti ovociti immaturi, che risultano molto resistenti ai processi di congelamento e scongelamento m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO Numerose cellule germinali Oociti immaturi e piccoli Assenza della zona pellucida e del fuso meiotico Opportunità di riparare i danni durante la crescita m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: prelievo laparoscopico la possibilità di essere effettuato con minimo preavviso evitando così di dover posticipare qualsiasi tipo di terapia oncologica; la bassissima percentuale di complicazioni intra- e post-operatorie; la breve durata dell'intervento (15-20 minuti); l'assenza di esiti aderenziali a distanza in sede di prelievo. m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: prelievo laparoscopico I frammenti possono essere prelevati incidendo superficialmente la corticale ovarica mediante forbici da laparoscopia o utilizzando uno specifico strumento metallico studiato per ottenere frammenti di 5 mm di diametro e 2-3 mm di spessore.

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: prelievo laparoscopico Se la paziente sara' curata con radioterapia pelvica esclusiva e non con chemioterapia (es. per un cancro della cervice uterina), e' anche possibile autotrapiantare temporaneamente l'ovaio in toto in altra sede (es. una tasca tra i muscoli dell'avambraccio) eseguendo una microanastomosi vascolare. Terminate le cure radioterapiche, l'ovaio potra' essere riportato nella sua sede d'origine anastomizzando il peduncolo vascolare ai vasi infundibolo-pelvici.

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: tecnica di congelamento La maggior parte dei protocolli attualmente in uso prevede il congelamento lento associato allo scongelamento rapido. I frammenti ovarici, posti nel terreno di congelamento all'interno di criotubi, vengono raffreddati gradualmente mediante un congelatore programmabile e successivamente immersi in azoto liquido, ove possono essere conservati per un tempo indeterminato

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: % survival rates La percentuale di sopravvivenza allo scongelamento dei follicoli primordiali varia nell'ovaio umano in base al crioprotettore utilizzato: è dell‘84% nel caso dell' Ethilen-Glicole (EG).

? CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Ottenere ovociti maturi TESSUTO OVARICO: scongelamento ? Ottenere ovociti maturi autotrapianto xenotrapianto Maturazione in vitro m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: Autotrapianto ortotopico Posizionamento dei frammenti ovarici crioconservati nella sede originaria (fossetta ovarica) mediante autotrapianto per via laparoscopica. Oktay e colleghi hanno dimostrato la possibilita' di attecchimento dei frammenti così trapiantati e la possibilità di indurre l'ovulazione con gonadotropine a distanza di 15 settimane e a sei mesi dall'autotrapianto

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: Autotrapianto ortotopico La tecnica è finalizzata a ripristinare l'ovulazione nella sede naturale dell'ovaio e offre teoricamente la possibilità di ottenere un concepimento spontaneo senza il ricorso a tecniche di fecondazione in vitro. La fossetta ovarica però non è altamente vascolarizzata e quindi essa non costituisce una sede ottimale per il trapianto. 1° gravidanza 2004 Donnez et al 2°gravidanza 2005 Meirow et al

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: Autotrapianto eterotopico sede: avambraccio sotto il muscolo brachio- radiale necessitano di IVF nessuna gravidanza rischio di ritrapiantare cellule neoplastiche m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE TESSUTO OVARICO: xenotrapianto animali di altre specie privati di "rigetto" immunologico (SCID mice)

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Maturazione in vitro Maturation Medium FSH solution (final conc. 0.075 IU/ml) hCG solution (final conc. 0.1 IU/ml) Patient serum (10%) Equilibration for 2 –3 hours at 37°C and 5 – 6% CO2 m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Unstimulated IVM cycle US scanning Blood sample Day 3 Day 7 - 10 Day 8 - 11 Oocyte pick -up Day - 1 Day 0 Day +1 Day +2 estradiolo progesterone

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Stimulated IVM cycle US scanning Blood sample Day 3 Day 7 - 10 Oocyte pick -up Day - 1 Day 0 Day +1 Day +2 estradiolo progesterone

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Maturazione in vitro IVM procedure Day -1 Pick – up ovocitario raccolta degli ovociti dal fluido follicolare utilizzando un apposito filtro Incubazione degli ovociti reclutati in LAG medium per 2 – 3 h Trasferimento in Maturation Medium m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Maturazione in vitro IVM procedure Day 0 dopo 28 – 30 h gli ovociti sono sottoposti al controllo per verificare l’avvenuta maturazione gli ovociti maturi sono sottoposti ad ICSI m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Maturazione in vitro IVM procedure Day 1 controllo della fertilizzazione mediante visualizzazione dei pronuclei IVM procedure Day 2 controllo della divisione cellulare e transfer embrionario m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE FEMMINILE Maturazione in vitro in cicli a fresco maturation rate ( 70 – 80%) fertilization rate ( 70 – 80%) cleavage rate ( 90 – 95%) Fine 2006: circa 500 bambini nati m. vento

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE INDICAZIONI • Pazienti affetti da patologie che necessitano di terapie inducenti danni alla spermatogenesi (patologie neoplastiche, autoimmuni, ecc.)

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE INDICAZIONI I principali tumori riscontrati nei pts che depositano spermatozoi presso le banche sono i tumori testicolari (seminoma, carcinoma embrionale, coriocarcinoma, teratoma e tumori misti composti da più di uno dei precedenti istotipi), linfomi di Hodgkin, non Hodgkin, leucemie.

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE INDICAZIONI Pazienti affetti da patologie che necessitano di interventi chirurgici all’apparato urogenitale che possono ledere la funzione eiaculatoria Soggetti che per motivi di lavoro sono esposti a sostanze potenzialmente genotossiche

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE Pazienti che si sottopongono a vasectomia Pazienti con eiaculazione retrograda Pazienti con lesioni del midollo spinale Pazienti inseriti nei programmi di F.A. CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE INDICAZIONI

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE INDICAZIONI Pazienti con oligoastenoteratozoospermia (OAT) che presentano transitori miglioramenti della qualità del seme • Pazienti che mostrano un severo e progressivo peggioramento della qualità del seme • Pazienti criptozoospermici

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE INDICAZIONI Pazienti affetti da azoospermia Prelievo testicolare Prelievo epididimario

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE Se il paziente deve subire trattamenti antiblastici o radioterapia, entrambi induttori di danno genotossico, è necessario eseguire la crioconservazione prima dell’inizio di qualsiasi trattamento CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE QUANDO ?

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE QUANDO ? Se il paziente è già stato trattato con chemio o radioterapici è opportuno attendere a scopo prudenziale circa due anni dalla fine della terapia stessa prima di effettuare una crioconservazione

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE QUANDO ? Nel caso di farmaci che non agiscono sul ciclo cellulare è possibile fare crioconservazione dopo tre mesi dalla sospensione del farmaco per utilizzare gameti derivanti da una nuova spermatogenesi, se ciò non interferisce con l’urgenza di iniziare un nuovo ciclo di terapia.

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE QUANDO ? Il periodo “finestra” utile per una corretta crioconservazione è quello tra l’intervento chirurgico di orchiectomia e l’inizio della chemio o radioterapia.

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE ANALISI DA EFFETTUARE pre-crioconservazione • Spermiocoltura e tamponi uretrali Virus EPATITE B: HBsAg • Virus EPATITE C: Anticorpi anti – HCV • HCV-RNA Qualitativo: (nel caso di anticorpi anti – HCV positivi ) • HIV: Anticorpi anti – HIV • CITOMEGALOVIRUS: Anticorpi anti IgG, Anticorpi anti IgM

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE ANALISI DA EFFETTUARE pre-crioconservazione • Virus EPATITE B: HBsAg • Virus EPATITE C: Anticorpi anti – HCV • HCV-RNA Qualitativo: (nel caso di anticorpi anti – HCV positivi ) • HIV: Anticorpi anti – HIV • CITOMEGALOVIRUS: Anticorpi anti IgG, Anticorpi anti IgM

CRIOCONSERVAZIONE DEL GAMETE MASCHILE PERIODO DI ASTINENZA Si consiglia un periodo di astinenza di 3 – 5 gg. In caso di urgenza di inizio della terapia non viene tenuto conto di tale limitazione

FATTORE DI CRIOSPERMIA CSF % di spz mobili dopo scongelamento X 100 > 50 % FATTORE DI CRIOSPERMIA

“Chilling Injuries” Modificazioni strutturali del bilayer lipidico Formazione di cristalli di ghiaccio intracitoplasmatici che aumentando il volume della cellula causano danni irreparabili alle strutture interne. ellulare che extracellulare tossicità del crioprotettore usato possibili danni da cambiamenti osmotici m. vento

CONCLUSIONI 1 La preservazione della fertilità in pazienti che devono sottoporsi a terapie antitumorali rappresenta un'esigenza fondamentale di un sistema sanitario evoluto che si faccia carico anche della qualita' della vita futura dei pazienti. Mentre per la crioconservazione dei gameti maschili sono stati raggiunti traguardi soddisfacenti tali da garantire buone percentuali di successo, ciò non è stato raggiunto con i gameti femminili m. vento

CONCLUSIONI 2 Anche se le tecniche attuali consentono di crioconservare per lunghissimo tempo frammenti di ovaio umano con buoni risultati in termini di sopravvivenza follicolare dopo lo scongelamento rimangono irrisolti due problemi di fondamentale importanza: qual’è la migliore strategia per impiegare i frammenti ovarici dopo lo scongelamento? come ottenere delle gravidanze senza rischiare di reintrodurre nella paziente anche cellule tumorali? m. vento

"Now it's time to freeze, time to thaw is coming“!!! CONCLUSIONI 3 Le gravidanze recentemente ottenute dopo autotrapianto del tessuto crioconservato, anche se casi isolati, dimostrano la fattibilità di preservare la fertilità femminile con questa metodica e accendono la speranza per centinaia di migliaia di pazienti "Now it's time to freeze, time to thaw is coming“!!! m. vento

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Servizio PMA U.O. Ostetricia e Ginecologia Azienda Ospedaliera “Cannizzaro” Direttore: Prof. Paolo Scollo Biologi della riproduzione Maria Elena Vento Adele De Palma Maria Rita Garofalo Ginecologi Placido Borzì Gabriella Poma Francesca Stimoli Ostetrica