The Drug Discovery Process  Program selection (disease)  Drug Target Identification and Target Validation  Lead Compound Identification  Lead Optimization  Preclinical and Clinical Development  Approval and Circulation

Scoperta di nuovi farmaci Scegli una malattia Scegliere un bersaglio farmacologico. Identificare un saggio biologico. Trovare un ’ lead compound'. Isolare e purificare il lead compound se necessario. Determinare la struttura del composto guida se necessario. Progettazione di farmaci Sviluppare le relazioni struttura-attività (SAR). Identificare il farmacoforo. Migliorare le interazioni con il target (farmacodinamica). Migliorare le proprietà farmacocinetiche. Sviluppo di farmaci Brevettare il farmaco Effettuare studi preclinici (metabolismo dei farmaci, tossicologia, formulazione e prove di stabilità, studi di farmacologia, ecc). Progettare un processo di fabbricazione (processo di sviluppo chimico ecc). Eseguire i test clinici. Registrare e commercializzazione del farmaco

CHOOSING A DISEASE La scelta di quale malattia affrontare è di solito una questione della strategia aziendale di mercato. La scienza diventa importante solo nella fase successiva L’elemento o il meccanismo biologico su cui intervenire per modificare la storia naturale di una malattia DRUG TARGET IDENTIFICATION QUALI BERSAGLI?

Come identificare nuovi target? L’identificazione di target molecolare è alla base della ricerca di farmaci innovativi  10 geni contribuiscono a malattie multifattoriali.  Questi geni sono correlati ad altri 5-10 prodotti genici nei circuiti fisiologici  Se questi numeri sono moltiplicati per il numero di malattie che causano i maggiori problemi medici, risultano potenziali nuovi targets Capire quali biomacromolecole sono coinvolti in un particolare stato di malattia è chiaramente importante

Approcci molecolare e sistematici alla scoperta di nuovi targets

TARGET IDENTIFICATION: Approccio molecolare GenomicaProteomica Associazione genica Approccio molecolare Campioni clinici ModelloMalattia Differenze tra tessuti sani e malati Espressione del RNA messaggero Proteine Polimorfismi genici Tecniche

GENOMICA PROTEOMICA Assoziazione genica

Genetica avanzata ModelloMalattia Approccio molecolare Modello cellulare TARGET IDENTIFICATION Fenotipo al gene Modulazione di un fenotipo della malattia

Genetica reverse ModelloMalattia Approccio molecolare Modello animale TARGET IDENTIFICATION Gene al fenotipo

Sequenziamento del genoma Determinazione della struttura e le funzioni di molecole biologiche Andrea G. B. Tettamanzi 2002 Drug Target Identification BIOINFORMATICA Modulazione dei fenotipi National Institutes of Health (NIH ) Ricerca, sviluppo ed applicazione di sistemi informatici e tecniche volte all’ elaborazione di dati biologici e/o medici, comprendenti l’acquisizione, l’organizzazione, l’archiviazione, l’analisi e la visualizzazione di detti dati National Center for Biotechnology Information (NCBI) La Bioinformatica e’ una scienza in cui la biologia, la medicina, le scienze computazionali e l’informazione tecnologica si fondono in una sola discip lina

Sviluppo di nuovi algoritmi e statistiche con cui valutare il rapporto fra membri di grandi insiemi di dati Analisi ed interpretazione di vari tipi di dati comprese le sequenze amminoacidiche, nucleotidiche, i domini della proteina e le strutture della proteina Sviluppo e realizzazione degli strumenti che permettono un efficiente accesso e amministrazione dei tipi differenti di informazione National Center for Biotechnology Information (NCBI) La Bioinformatica si occupa

TARGET VALIDATION Tecniche in vitro /in vivo Consentono modulare sia l’espressione sia la funzione di un gene/proteina Una bio(macro)molecola è definita target se dimostra essere critica per lo sviluppo di una malattia Espressione di RNA messaggero direttalivello trascrizionale espressione della proteina dominante negativa e wild-type o utilizzando anticorpi bloccanti / o stimolare aptameri Funzione della proteina

TARGETS  Proteine  Acidi nucleici  Altri

Amino acids PROTEINE: i loro building block

Struttura primaria delle proteine

α helix Struttura secondaria delle proteine β sheet β turn

Supersecondary structures: “motivi” Helix-Loop-Helix (EF-Hand) Zn-finger Combinazione di  -eliche ed strutture  connesse attraverso “loops”  Barrel Greek key

COILED COIL MOTIF

Come si piega una proteina in una conformazione compatta Strutturaterziariadelleproteine legami che intervengono nel piegamento delle proteine

Domini nella struttura terziaria di proteine struttura terziaria di proteine  Domini strutturali  Domini funzionali Pyruvate kinase

Cytochrome b 562 Enzyme lactic dehydrogenase Dominio semplice coinvolto nel trasporto di elettroni nel mitocondrio Dominio missto di  e  strutture binding con NAD Dominio ad  strutture Light chain Immunoglobulin (antibody)

Struttura quaternaria delle proteine  Associazione di multipli catene proteiche individuali in una singola proteina con multiple subunità  Il riordinamento di queste subunità da luogo ad una struttura proteica stabile  Le catene nell’oligomero possono essere la stessa proteina (omoligomeri) o una combinazione di differenti catene proteiche (eterooligomeri)  In generale, le subunità si mantengono unite attraverso forze intramolecolare non covalente anche se possono contenere ponti disolfuri

PROTEINE TIPOFUNZIONEESSEMPI Strutturali Supporto : forma ed struttura Motori Stoccaggio di proteine Collageno elastine keratina Actina Tubulina Ovalbumina, glutene, caseine… TrasportatoriTrasportano ioni legandi EnzimiCatalizza reazione biologiche Tripsina, adenilato ciclase, kinase.. Regolatori Segnali cellulari o regolatori dei processi metabolici Ormone, fattori di crescita, fattori di trascrizione, fattori nucleari RecettoriTrasmissione del segnaleGlutammato R, Steroide R…. DifensiviProtettivaAnticorpi, fibrinogeno, trombina

TARGET DRUGGABILITY : definisce la capacità di un bersaglio di essere modulato in modo efficace da un legando a basso peso molecolare con proprietà biochimico-fisiche e farmacocinetiche appropriate perché possa diventare un farmaco adatto all’impiego terapeutico desiderato Proteine come target

capacità di un bersaglio di essere modulato in modo efficace da un legando Sito di binding

Proteine strutturali: target farmacologico TUBULINA Proteina globulare che costituisce l'unità fondamentale delle strutture del citoscheletro dette microtubuli. Nel citoplasma la tubulina è presente sotto forma di dimero α/β. Entrambe forme sono in grado di riconoscere e legare GTP e, almeno la subunità β, di idrolizzarlo. Tubulina è presente in due forme: la tubulina GTP e la tubulina GDP. La tubulina, quando lega il GTP presenta un'elevata affinità per altre tubuline, e risulta allora essere polarizzata, dal momento che questa affinità è maggiore nella subunità β.: I microtubuli sono in grado di allungarsi e contrarsi generando una forza capace di mobilitare certe proteine motorie lungo i microtubuli.

Una notevole struttura che coinvolge microtubuli è il fuso mitotico utilizzato dalle cellule eucariotiche per separare correttamente i loro cromosomi durante la divisione cellulare. I microtubuli anche spostano organelli e strutture cellulari a nuove posizioni Struttura che coinvolge microtubuli: il fuso mitotico

PROTEINE TRASPORTATORI

PROTEINE TRASPORTATORI: Strutture

OCTs OCTNs OATs PEPT1 PEPT2 Organic Ions CNT1 CNT2 CNT3 Nucleosides ENT1 ENT2 Nucleosides DAT NET GAT1 SERT Neurotransmitters OATPs Organic Anions NRAMP1 DMT1 IREG1 Oligopeptides Fe +++ MATE1-2 MDR1 MDR3 BSEP MRP1-4 Hydrophobic Cations Hydrophobic Anions Organic Cations VMAT VAChT Selezionati Trasportatori di Membrana nel Genoma Umano ABC Family ~ 50 SLC Family ~ 300

Proteine trasportatori come bersagli farmacologici  Trasportatori di neurotrasmettitori nel trattamento di disturbi neuropsichiatrici. SERT (SLC64A) bersaglio degli inibitori del re-uptake della serotonina (ISRS)  Altri trasportatori deputati al re-uptake dei neurotrasmettirori fungono da bersaglio per antidepressivi triciclici, per diversi tipi di anfetamine e per gli anticonvulsivanti. Questi trasportatori possono essere anche coinvolti nella patogenesi di disturbi neuropsichiatrici: Alzheimer o Parkinson

 Trasportatori non neuronali possono essere bersagli potenziali di farmaci  Trasp. del colesterolo Patologie cardiovascolare  Trasp. di nucleosidi Patologie tumorale  Trasp. del glucosio Sindrome metaboliche  Antiiporter Na + -H + Ipertensione Resistenza ai farmaci  Trasportatori di membrana svolgono un ruolo critico nello sviluppo della resistenza Farmaci anticancro Agenti antivirali Anticonvulsivante Ruolo dei trasportatori : trasportatori come bersagli farmacologici

Recettore: macromolecola o insieme di macromolecole cellulari deputate alla trasmissione di un segnale chimico all’interno delle cellule

RECETTORI COME SISTEMI Di TRASDUZIONE La trasduzione del segnale è il processo attraverso il quale il segnale che provoca l’attivazione del recettore viene trasformata in altre forme chimiche, una o più proteine 'trasduttrici’, dando luogo ad una modificazione cellulare strutturale e funzionale (risposte)

Permette a molecole extracellulare di influenzare le funzione cellulare senza entrare all’interno della cellula Diversi segnali differenti possono influenzare facilitando l’attivazione di proteine enzimatiche regolatori attraverso un meccanismo metabolico comune od opposto Attraverso l’attivazione di enzimi e la produzione di secondi messaggeri un segnale iniziale debole può essere amplificato, e la sua durata prolungata, per produrre una potente risposta cellulare

MessengerSourceEffect cAMPAdenylyl cyclase Activates protein kinases cGMPGuanylyl cyclase Activates protein kinases, regulates ion channels, regulates phosphodiesterases Ca 2+ Activates protein kinases, activates Ca 2+ -modulated proteins IP 3 PLC action on PIActivates Ca 2+ channels DAGPLC action on PIActivates protein kinase C Phosphatidic acid Membrane component and product of PLD Activates Ca 2+ channels, inhibits adenylyl cyclase CeramidePLC action on sphingomyelinActivates protein kinases Nitric oxide (NO)NO synthase Activates guanylyl cyclase, relaxes smooth muscle Cyclic ADP-ribose cADP-ribose synthaseActivates Ca 2+ channels Secondi messaggeri

The striking similarity between intracellular signalling pathways and the Tokyo subway system

 Recettori intracellulari (modulatori della trascrizione).  Recettori accoppiati ad una chinasi (recettori con attività enzimatica intrinseca);  Recettori accoppiati ad un canale ionico (ionotropi);  Recettori accoppiati alle proteine G (metabotropi); Famiglie Recettoriali Sulla base della struttura molecolare e della natura dei meccanismi di trasduzione si possono distinguere quattro tipi o superfamiglie di recettori

Formano omodimeri o dimeri con il ligando Fanno parte i recettori per gli ormoni steroidei (glucocorticoidi, mineralcorticoidi, progesterone, estrogeni). Un altro esempio è rappresentato dall’ossido nitrico (NO), che diffonde attraverso la membrana cellulare e stimola la guanilciclasi inducendo la formazione di c-GMP RECETTORI INTRACELULLARI modulano la trascrizione genica delle cellule bersaglio

RECETTORI CITOPLASMATICI Glucocorticoids

 Trasducono il segnale portato da ormoni e da altri mediatori lipofilici (ormoni steroidei e tiroidei, acido retinoico, vitamina D, ecc) anche se Il meccanismo di attivazione non sempre richiede un ligando specifico  L’attività intracellulare non è mediata da secondi messaggeri (hanno la capacità di legare direttamente il DNA per regolare la trascrizione di geni specifici)  Interagiscono con il genoma, modificando l’espressione genica e quindi la composizione proteica della cellula Ruolo dei recettori intracellulari Regolazione della crescita Differenziamento e Omeostasi cellulare Recettori nucleari

Organizzazione strutturale di un recettore nucleare Legano DNA come omodimeri o eterodimeri Mediante DBD (DNA Binding Domain) legano sequenze regolative HRE (Hormone Responsive Element) a monte di geni target Attivano la trascrizione grazie all’ AD (Activation Domain) La trasduzione del segnale avviene grazie a risposta primaria e secondaria

Classificazione dei recettori nucleari Ormoni tiroidei, recettore TR alfa e beta Estrogeni, recettore ER, alfa e beta Testosterone, recettore AR Progesterone recettore PR Aldosterone, recettore MR Cortisolo, recettore GR Ormoni Vitamine 1,25- (OH)2-colecalciferolo: recettore VDR Acidi retinoici: recettore acido retinoico alfa, beta e gamma Acido 9-cisretinoico: recettore RXR i alfa, beta e gamma Metabolici Acidi grassi, recettore PPAR ( peroxisome proliferator activated receptor) alfa, beta e gamma Ossisteroli recettore LXR alfa e beta Acidi biliari, recettore BAR

Recettori transmembrana legati ad una proteinchinasi  Associati direttamente ad una tirosina chinasi  Attività tirosinchinasica (catalizza il trasferimento di gruppi fosfati dall’ATP a substrati proteici, fosforilando residui di tirosina)  Mediano l’attività biologica di Fattori di crescita Ormoni Citochine EGF (epidermico)INSULINA Erotropoietine PDGF (derivato dalle piastrine) Ormone della crescitaInterleukine 2, 3, 6 NGF (nervoso)Interferone IGF (insulinico) FGF (fibroblasti HGF (epatociti) VEGF A-B-C (vasculo- endoteliale) Neurotrofine

Schema delle strutture delle principali famiglie di recettori associati a tirosin-chinase (RTK) umani

Interesse farmacologico per i fattori di crescita  Coinvolgimento nella patogenesi delle neoplasie e di alcuni difetti metabolici  I fattori di crescita, i loro recettori e i trasduttori del segnale sono i prodotti dei cosiddetti proto-oncogeni od oncogeni cellulari Questi geni in condizione fisiologiche, sono deputati al controllo della proliferazione; le loro controparti mutate o espresse in forma aberrante (oncogeni attivati), sono capaci di indurre trasformazione neoplastica in sistemi sperimentali e sono associati in maniera critica all’insorgenza dei tumori umani

Mutazione recettore del fattore di crescita del fibroplasto

RECETTORI CANALI IONICI (RECETTORI IONOTROPICI)  I canali ionici sono dei complessi macroproteici (glicoproteine) transmembranari contenente un poro idrofilico che permette il flusso d’ioni secondo il gradiente elettrochimico dell’intorno  La loro attivazione determina dei rapidi cambiamenti delle concentrazioni ioniche intracellulari e del potenziale elettrico:  I recettori canale sono oligomeri formati da 3, 4 o 5 subunità

Classificazione dei recettori canali sulla base della apertura ed attivazione del canale

Recettori canali voltaggio dipendenti ed ligando dipendenti

Structure of a typical voltage- gated ion channel

Topology of the voltage-gated ion channels

Strutture d’un canale ionico dipendente dal ligando

Recettori accoppiati a proteina G RECETTORI METABOTROPI

Classificazione recettori accoppiati a proteine G  Class A (or 1) Rhodopsin-like  Class B (or 2) Secretin receptor family  Class C (or 3) Metabotropic glutamate/pheromone  Class D (or 4) Fungal mating pheromone receptors  Class E (or 5) Cyclic AMP receptors  Class F (or 6) Frizzled/Smoothened

Proteina G Le proteine G (così chiamate per la loro interazione con i nucleotidi guaninici GTP e GDP) consistono di tre subunità ancorate alla membrana plasmatica, ,  e . I nucleotidi guaninici sono legati alla subunità . Nello stato a riposo, la proteina G esiste come trimero indissociato con GDP che occupa il sito sulla subunità 

Receptors and Small G-proteins

 Piccole G- proteins (GTPases) sono un gruppo de proteine coinvolte nella regolazione di differenti processi cellulari  Sono monomeri proteici da kD  La subnità  delle eterotrimeriche proteine G è 45kD Small G-proteins

Classificazione delle piccole proteine G in funzione dell’omologia di sequenze Classificazione delle piccole proteine G in funzione dell’omologia di sequenze Organizzazione del citoscheletro Trasporto nucleare Trasporto vescicolare Proliferazione e differenziazione cellulare Organizzazione del citoscheletro

Recettori orfani  Recettori appartenenti a famiglie recettoriali note (recettori accoppiati a proteina G e recettori nucleari) senza ligandi endogeni o esogeni conosciuti Recettore orfano GRP20

Il caso del recettore orfano ROR Meccanismo d’azione, Funzioni fisiologiche Ruolo nelle malatia