Disordini genetici della sintesi dell'emoglobina EMOGLOBINOPATIE Disordini genetici della sintesi dell'emoglobina Hemoglobin (Hb), the oxygen transport molecule, consists of two a-like and two b-like globin chains that are covalently linked to heme, the oxygen-binding group.

Emoglobine normali

ONTOGENESI dell’EMOGLOBINA Durante la vita embrionale vengono prodotte le emoglobine embrionali (Gower 1, Gower 2 e Portland) che vengono poi sostituite dapprima dall’emoglobina fetale (Hb F:a2g2) e poi dalla produzione di emoglobine di tipo adulto (HbA:a2b2 e HbA2:a2d2) Nell’adulto la globina della Hba è costituita da 2 catene polipeptidiche alfa e 2 catene beta (a2b2).

Cluster globinico Per ogni genoma aploide esistono 2 geni globinici, localizzati lungo il cromosoma 16

LE EMOGLOBINOPATIE Circa il 7% della popolazione mondiale è portatore di diverse malattie ereditarie dell’emoglobina, rendendole le più comuni malattie monogeniche in assoluto Vi sono 2 gruppi principali di alterazioni: varianti strutturali dell’emoglobina Talassemie - difetti di sintesi delle catene globiniche Un 3° gruppo è rappresentato dalla persistenza ereditaria di emoglobina fetale (HPFH), difetto del normale switch di produzione di emoglobine da fetali ad adulte

I DISORDINI EREDITARI DELL’EMOGLOBINA Le talassemie sono classificate in a,b, db sulla base della catena/e globinica/che non sintetizzata/e. Le varianti strutturali dell’emoglobina sono dovute, invece, alla sostituzione di un singolo aminoacido nelle catene a o b delle globine

LE Hb VARIANTI Sono state identificate oltre 700 Hb varianti, ma solo 3 sono presenti con una maggiore frequenza in varie popolazioni HbS Africa sotto il Sahara parte del Mediterraneo medio-oriente parte dell’India HbC solo Africa ocidentale HbE India Asia sud-est

normally (chromosome 11) Patogenesi dell’HbS normally (chromosome 11) Pro Glu Glu Lys a.a. 1 2 3 4 5 6 7 8 . . . Val His Leu Thr normal -globin normal RBC -globin gene GAG In SCA Pro Val Glu Lys a.a. 1 2 3 4 5 6 7 8 . . . Val His Leu Thr Glu6Val mutation GTG -globin gene Single base change sickled RBC Sostituzione nell’aminoacido 6 di un acido glutammico con una valina.

HbS - effetto della mutazione L’acido glutammico ha una carica negativa, la valina non ha carica Very hydrophilic hydrophobic

Glu6Val introduce uno spot idrofobico nella -globina

Hb S deossigenata aggrega Glu6Val spot idrofobico deossigenato Interazione dei 2 spots idrofobici I residui idrofobici cosi creati tendono a precipitare fornendo la caratteristica forma a falce del globulo rosso.

Patogenesi dell’anemia falciforme

HbS - Ereditarietà Autosomica recessiva bSbS bAbS Genitori portatori

HbS - Caratteristiche cliniche Sintomi clinici prevalentemente in caso di omozigosi legati a : Anemia emolitica cronica Asplenia (infarti splenici) Fenomeni vaso-occlusivi piccoli e grossi vasi Causa più importante di morbidità e mortalità.

Tratto falciforme Soggetti eterozigoti AS I portatori sono clinicamente normali, ma con globuli rossi falciformi quando sottoposti a bassa ossigenazione in vitro

Diagnosi di anemia falciforme Emocromo con stricio Elettroforesi delle globine Studi familiari Ricerca diretta della mutazione nel gene della globina dei pazienti

Cellule falciformi normal RBCs (22) average cell survival 120 days sickle cell RBCs in crisis average cell survival 10-20 days

Caratteristiche ematologiche Anemia falciforme Conta WBC elevata Reticolociti elevati (5-15%) Striscio di sangue Poichè vengono prodotti g. rossi di dimensioni ridotte e vita più breve, il midollo osseo è stimolato a produrre più g. rossi e quindi precursori rappresentati dalla quota dei reticolociti .

Diagnosi di HbS Elettroforesi delle globine Elettroforesi delle globine è un’elettroforesi zonale caratterizzata da un supporto solido come acetato di cellulosa. Poichè la mutazione crea un sito di restrizione effettuiamo un’analisi mediante RFLP la mutazione responsabile dell’HbS elimina un sito di restrizione analisi mediante RFLP

Diagnosi molecolare di HbS

HbS - Prognosi e trattamento Aspettativa di vita 40-50 anni Trattamenti Di supporto: trasfusioni, antibiotici Trattamenti degli stati dolorosi acuti e cronici Trapianto di midollo

Talassemie Le alfa e beta-talassemie sono un gruppo di disordini ereditari genetici del sangue caratterizzati da ridotta o assente sintesi di a o b-globina, con conseguente ridotto contenuto emoglobinico nei globuli rossi, ridotta produzione di globuli rossi ed anemia. Sono trasmesse con carattere autosomico recessivo

Le talassemie sono malattie del sangue che colpiscono i paesi che si affacciano sul mare mediterraneo Le b-talassemie comprendono tre forme: Talassemia major (anemia mediterranea) Talassemia intermedia Talassemia minor (condizione di portatore sano per b-talassemia).

Talassemie Oltre alle talassemie alfa e beta che sono di gran lunga le più comuni, possiamo ancora avere le talassemie db, gdb, d Le talassemie a e b possono essere suddivise in a ° e a+ o b° e b+ se le catene non sono assolutamente sintetizzate (°) o lo sono in misura ridotta (+), rispettivamente.

EMOGLOBINE DELL’ADULTO Nell’adulto la globina della HBA è costituita da 2 catene polipeptidiche alfa e due catene beta (a2B2). Ogni individuo adulto possiede 4 geni alfa ( due di deriv. Materna e due di deriv paterna) e due geni beta ( uno di derivazione materna ed uno di derivazione paterna), due geni delta per la costituzione dell’HbA2 e quattro geni gamma (due di deriv. Materna e due di deriv.paterna).

Epidemiologia La beta Talassemia è prevalente nei paesi del Mediterraneo, in medio oriente, nel Sud est asiatico, in India nel sud della Cina, nei paesi del Nord Africa e del Sud America. Il più alto numero di portatori è presente a Cipro (14%) seguono la Sardegna ed il sud est asiatico. Le migrazioni di popolazioni ed i matrimoni tra etnie diverse hanno introdotto la talassemia in quasi tutti i paesi del mondo. L’incidenza totale annua di pazienti sintomatici è stimata a 1 su 100000 in tutto il mondo

Eziologia Di oltre 200 mutazioni del gene beta globinico ad oggi rinvenute, sono circa 40 quelle responsabili della maggioranza delle talassemie nel mondo. Mutazioni puntiformi che determinano una riduzione o assenza della sintesi di catene  globiniche In funzione della parziale (b+) o totale (b0) soppressione della sintesi delle catene b globiniche, si determina un eccesso di catene che porta ad una eritropiesi inefficace. Il grado di riduzione della sintesi delle catene globiniche dipende dalla natura della mutazione del gene b-globinico Ipocromia e microcitemia: globuli rossi di idmensioni ridotte e con scarsa colorazione Anemia emolitica: bassa concentrazione di globuli rossi dovuta ad una forte emolisi e quindi distruzione degli stessi a livello della milza

TALASSEMIE b: sintomatologia Allo stato di omozigote tutte le forme di b-talassemie si accompagnano a gravi forme di anemia. I pazienti b-talassemici possono essere tenuti in vita per mezzo di continue trasfusioni; la morte sopraggiunge normalmente entro la seconda decade per le complicanze secondarie all’accumulo di ferro La lesione principale é l’elevatissima produzione di catene a (poco solubili e facilmente precipitabili con formazione di aggregati) e difettosa (b+) o addirittura assente (b° - Hgb F a2g2) produzione di catene b.

Talassemia e Hb

-Talassemia Anemia ipocromica e microcitica causata da un deficit di sintesi di -globina Lo sbilanciamento nella sintesi globinica porta a precipitare le catene  in eccesso Molto comune nel bacino del MEDITERRANEO

Basi molecolari della -talassemia Cromosoma 11 2 geni globinici per ciascun individuo Deficit della globine non altera la sintesi dell’HbF ma solo dell’HbA con comparsa della patologia dopo qualche mese dalla nascita, quando termina la scorta di HbF

-Talassemia: schema mild  thal. minor + thal. b thal. major 0 clinical severity + b thal. major + 0 0 thal. 0 extreme

Descrizione Clinica Gli individui con talassemia major abitualmente presentano una sintomatologia entro i primi due anni di vita e richiedono regolari trasfusioni di sangue. Nella talassemia intermedia, invece i pazienti presentano sintomi clinici più tardivi e non richiedono regolari trasfusioni di sangue. I portatori eterozigoti di talassemia sono portatori sani dello stato talassemico. Il meccanismo fisiopatologico della b-talassemia dipende dal’eccesso di catene alfa che si viene a produrre in conseguenza del deficit di catene b. Le catene in eccesso precipitano lungo la membrana eritrocitaria determinando l’emolisi

TALASSEMIA MINOR eterozigosi + “Anemia” più frequente in Italia, con tipica diffusione in alcune zone (Italia meridionale, isole e zone del delta padano) Ridotta sintesi di catene  Diagnosi per lo più casuale, raramente moderati sintomi anemia dipendenti

TALASSEMIA MINOR-MINIMA Eterozigosi EMOCROMO NORMALE  TALASSEMIA MINOR-MINIMA Hb g/dL 15.0 10-15 Eritrociti x 106/L 5.000.000 6.000.000 HCT (%) 45 35 MCV (3) 90 60 Elettroforesi Hb Hb A2 < 3% Hb A2  3% L’ematocrito rappresenta la percentuale del volume sanguigno occupata dalla componente eritrocitaria MCV : volume corpuscolare medio HBA2: alfa2gamma2

HbA a2b2 96% HbA2 a2d2 3% HbF a2 g2 1%

Mutazioni -Talassemia Sono state identificate numerose mutazioni -talassemiche, tanto che i soggetti con 2 alleli talassemici sono in genere eterozigoti compositi piuttosto che omozigoti per una sola mutazione Alcune mutazioni vengono identificate nei pazienti con maggiore frequenza rispetto ad altre La distribuzione delle mutazioni nelle varie popolazioni permette di selezionare il protocollo di screening più idoneo

Frequenza di mutazioni talassemiche in diverse popolazioni

Modalità di trasmissione della talassemia

TIPI DI MUTAZIONE NELLA B-TALASSEMIA

Struttura del gene b-globinico Mutazioni più frequenti in Italia 0 °39 stop codon aa 39 °IVS1-1 sito canonico di splicing +IVS1-6 consensus splicing +IVS1-110 splicing alternativo in IVS1 +IVS2-745 splicing alternativo in IVS2 + 0 + b°6 IVSI-1 IVSI-110 b°39 IVSII-745 -87 IVSI-6 Struttura del gene b-globinico

Significato funzionale delle mutazioni italiane °39 +IVS1-110 -Sintesi di una catena globinica tronca, in seguito all’introduzione di un codone di stop. -Attivazione di un sito criptico di splicing intronico, determinando la produzione di un mRNA abnorme.

Mutazioni più frequenti in Italia

Diagnosi molecolare di -talassemia INDIVIDUAZIONE DI MUTAZIONI b -TALASSEMICHE MUTAZIONI RARE MUTAZIONI FREQUENTI REVERSE DOT-BLOT amplificazione allele-specifica (ARMS) SSCP ANALISI DI SEQUENZA

IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE NELLA B-TALASSEMIA

Kit Diagnostici

con primers biotinilati Reverse dot blot (RDB) Sonde ASO (allele specific oligonucleotide) per 8 diverse mutazioni per l’a-b talassemia, sono immobilizzati su pozzetti di una micropiastra. Amplificazione DNA con primers biotinilati Denaturazione

(nel caso di un campione normale) Schema della reazione (nel caso di un campione normale) Oligonucleotidi allele-specifici immobilizzati nei pozzetti Ibridazione con DNA biotinilato del campione. Lavaggio Aggiunta coniugato SA-HRP. Lavaggio Aggiunta del substrato H2O2 e TMB Lettura a 450 nm SA-HRP: streptavidina-perossidasi TMB: tetrametilbenzidina

La rivelazione dell’avvenuta ibridazione attraverso una reazione Risultati La rivelazione dell’avvenuta ibridazione attraverso una reazione enzimatico-colorimetrica (colore giallo), indica quali sequenze (nomali o mutate) sono presenti nel campione. eterozigote (kit mDx BeTha Gene 1- Bio-Rad)

(Amplification Refractory Mutation System (ARMS) IDENTIFICAZIONE DI MUTAZIONI NOTE NELLA B-TALASSEMIA mediante Amplificazione Allele-Specifica (Amplification Refractory Mutation System (ARMS) Nella prima PCR un primer comune abbinato con un primer Normale disegnato in modo che il nucleotide in posizione 3’ sia complementare a quello presente sull’allele normale Nella seconda PCR - un primer comune abbinato con un primer mutato disegnato in modo che il nucleotide in posizione 3 ’sia complementare a quello presente sull’allele mutato

ARMS Amplification refractory mutation system Nella prima PCR un primer Normale disegnato in modo che il nucleotide in posizione 3’ sia complementare a quello presente sull’allele normale. Nella seconda PCR un primer Mut disegnato in modo che il nucleotide in posizione 3 ’sia complementare a quello presente sull’allele mutato

Amplificazione allele-specifica ARMS Nel caso di un individuo omozigote normale: amplificato solo con il primer A wild type Nel caso di un individuo omozigote mutato : amplificato solo con il primer B mutato Nel caso di un individuo eterozigote : amplificato sia con primer A e primer B

Esempio di amplificazione allele specifica mediante ARMS N M C C portatore

Mutazioni rare Analisi del polimorfismo di conformazione del DNA a singolo filamento SSCP (Single strand conformation polymorphism) Permette di evidenziare il polimorfismo della conformazione del DNA a singolo filamento - Dopo la PCR il DNA amplificato viene denaturato al calore e rapidamente raffreddato per evitare che si rinaturi I singoli filamenti vengono esaminati mediante elettroforesi su gel di acrilammide non denaturante E’ basato sulla differenza di mobilità elettroforetica tra DNA mutato a singolo filamento rispetto a quello non mutato

Single strand conformation polymorphism (SSCP) Sostituzione di un solo nucleotide Diversa conformazione 3D di ssDNA Diversa mobilità elettroforetica La conformazione che assume un singolo filamento di DNA è strettamente legata alla sua sequenza nucleotidica Anche una sola variazione nella sequenza determina conformazioni differenti La mobilità elettroforetica del DNA a singolo filamento è in funzione della sua conformazione Eventuali variazioni a livello nucleotidico altererano la mobilità elettroforetica Le bande "anomale" corrispondono al filamento di DNA in cui sono presenti le alterazioni nucleotidiche

DNA a singolo filamento SSCP Amplificazione del DNA (PCR) Denaturazione DNA amplificato DNA a singolo filamento Elettroforesi su gel di acrilammide Bande in posizione anomale

SSCP A: normale B: eterozigote

DIAGNOSI PRENATALE b-talassemia -TALASSEMICHE MUTAZIONI FREQUENTI REVERSE DOT-BLOT amplificazione allele-specifica (ARMS) ANALISI DI SEQUENZA

DIAGNOSI PRENATALE MEDIANTE AMPLIFICAZIONE ALLELE SPECIFICA (ARMS) C C

a-Talassemia e Hb

Patologia molecolare delle a-talassemie Sono determinate da delezioni che rimuovono tutto o parte del cluster dei geni per la globina a. Sono state decritte almeni 18 lesioni che rimuovono entrambi i geni delle a globine. In due di esse rimuovono tutto un gene e parte dell’altro. Anche il gene z può essere assente. In questo caso abbiamo un fenotipo a°. Questo tipo di delezioni è limitato a particolari regioni geografiche.

Genotipi -Talassemici Condizione n° geni genotipo HbA Normale 4  100% Carrier silente 3  75% Tratto talassemico Anemia lieve, microcitosi 2   50% HbH (4) anemia emolitica moderatamente severa 1  25% HbBart (4) e idrope fetale  0%

Talassemie + Questo tipo di talassemia deriva dalla delezione di una o dell’altro dei geni  o da mutazioni che li inattivano Delezioni. Il caso più comune deriva da delezioni dovute a disallineamento durante la meiosi. In questo caso si possono ottenere cromosomi contenenti un singolo gene () o una triade (del tipo 211). La ragione dell’alta frequenza di questa condizione deriva dalla alta omologia nelle sequenze codificanti per le globine alfa

-Talassemie

Talassemie + non causate da delezioni. Queste talassemie dipendono da mutazioni singole o multiple dei geni della globina alfa. La maggior parte riguardano il gene 2 e provocano effetti più importanti di quelli causati da delezioni.

Diagnosi genetica di -Talassemia: gap-PCR FIGURE 6. A: Schematic representation of the gap-PCR concept for rapid detection of known large deletions and/or genomic rearrangements. Two oligonucleotide primer pairs (Pr1/Pr2 and Pr1/Pr3) are designed to detect the wild-type allele and that with the deletion (depicted in gray), respectively.The deletion-speci¢c primer set (Pr1/Pr3) is designed such that a PCR product (Del, usually smaller than the wt) is generated only in the presence of the deletion, and at the same time no ampli¢cation occurs at the wild-type allele, since the complementary sequence of Pr2 will be missing due to the deletion. Similarly, amplification in the wild-type allele from the wild-type-specific primer pair (Pr1/Pr2) yields a differently-sized PCR product (wt); however, no ampli¢cation occurs with the deletion-speci¢c primer set, becausePr3 is located far away fromPr1. A similar strategy is implemented for the detection of gross rearrangements. B: Identi¢cation of theTurkish type of inversion/deletion db-thalassemia by gap-PCR. For breakpointA, lanes1and 4 correspond to wild-type individuals, and lanes 2 and 3 correspond to heterozygotes for the aforementioned deletion. Identi¢cation of breakpoint B in these samples with di¡erent primer sets (lanes 1 and 2) con¢rmed the presence of this deletion. M: uv174/HaeIII size marker. C: Identi¢cation of the 13.4 kb deletion, which is responsible for Sicilian db-thalassemia. Lane 1: Normal individual. Lanes 2 and 3: Heterozygous and homozygous sample for the deletion, respectively. M: jw174/HaeIII size marker.

Terapia convenzionale Nei soggetti affetti, il trattamento di supporto include trasfusioni di sangue, cure contro le infezioni, splenectomia

Terapia non convenzionale: Trapianto di midollo osseo(TMO) Trapianto di cellule staminali

Trapianto di midollo osseo I geni determinanti la compatibilità tissutale sono raggruppati come Complesso Maggiore di Istocompatibilità (MHC) – HLA Requisito fondamentale per il TMO è la disponibilità di un donatore HLA-compatibile

TMO allogenico Da donatore singenico (gemello monocoriale) Da donatore familiare HLA identico Da donatore familiare HLA non - identico Da donatore HLA identico non - correlato

Probabilità di trovare un donatore HLA - identico Nella famiglia: 25% Nei donatori geneticamente estranei: a) numero di donatori disponibili b) eterogeneità etnica della popolazione c) frequenza degli aplotipi

Trapianto di cellule staminali Sostituire il compartimento emopoietico alterato con un patrimonio di cellule staminali ottenuto da un donatore sano capace di ricostituire il sistema emopoietico ed immunitario del ricevente

Fonti di cellule staminali Midollo osseo Sangue periferico Cordone ombelicale Tessuti fetali Embrioni

(Per l’identificazione PREVENZIONE Screening (Per l’identificazione del portatore sano) Diagnosi prenatale (per una scelta consapevole ) Campagne di informazione Consulenza genetica