Penetrazione e svestimento Dopo l’adesione, la penetrazione, una fase energia-dipendente, accade rapidamente. Distinguiamo 3 diverse modalità di penetrazione: 1. Endocitosi della particella intera che produce accumulo di particelle virali in una vescicola del citoplasma. Es. virus privi di envelope (polio), con envelope (orthomyxoviruses) Processo pH-dipendente 2. Fusione dell’envelope con la membrana cellulare e liberazione diretta del capside nel citoplasma Es. paramyxo e herpes virus e HIV. Processo pH-indipendente 3. Traslocazione, attraverso la membrana cellulare definita come traslazione recettore-mediata Es. Picornavirus, capside modificato?

1. Traslocazione. (traslazione recettore-mediata). Modalità di ingresso tipica dei virus più piccoli, come i picornavirus. a. Il capside non arriverebbe indenne nel citoplasma, ma subirebbe, un’azione enzimatica che comporterebbe l’ingresso di un virus con il capside modificato. b. Un’altra ipotesi è che il capside modificato rimanga fuori dal citoplasma, e solo l’acido nucleico riesca ad arrivare all’interno della cellula, passando attraverso un capside “scompaginato” e i pori della membrana citoplasmatica.

Penetrazione di virus nudi Un esempio è il poliovirus della famiglia picornavirus. Un icosaedro T=3: Dopo il legame al recettore, il virus è endocitato in un endosoma. pH – esposizione del dominio idrofobico nelle proteine del capside. Durante questo processo VP4 è perso ; VP2 può anche essere perso. Ciò aumenta la flessibilità della particella. L’RNA genomico è iniettato attraverso un poro dell’endosoma nel citoplasma. E’ possibile che il poliovirus possa entrare nel citoplasma direttamente con un processo pH- indipendente.

Penetrazione di virus nudi ipotesi della endocitosi recettore-mediata

Penetrazione del genoma Picornavirus : adsorbimento al recettore cellulare genoma direttamente nel citoplasma

endocitosi Mediata dai recettori cellulari, la particella virale viene inglobata in un vacuolo formato dalla membrana cellulare virus privi di envelope (polio), con envelope (orthomyxoviruses)

The pH-dependent process involves endocytosis of a virus. Orthomyxoviruses, such as influenza, enter cells in this way. Endocytosed vesicles form bodies called endosomes. Antireceptor for influenza virus is haemaglutinin. From the picture above you can see that the viral and cell membranes are some distance apart (100Ä) after cleavage. The fusion domain is also inaccessible in the interior of HA2. Additional conformational changes induced by pH 5-6 in the endosome bring the fusion domain out of the interior of HA. The two membranes are now linked. HA2 sequences then melt into the lipid bilayer of the cell drawing the viral membrane closer. HA2 known to induce lipid mixing of different bilayers, but mixing of cell contents cannot take place until membrane fusion occurs.

Fusione dell’envelope con la membrana cellulare

Fusione dell’envelope con la membrana cellulare e liberazione del nucleocapside nel citoplasma. Orthomyxo, paramyxo e picornavirus tutti perdono il capside entrando nel citoplasma. Per herpesviruses, adenoviruses e papovaviruses, il capside è indirizzato attraverso il citoscheletro verso la membrana nucleare.

Nel caso di HIV, il più studiato nella famiglia delle Retroviridae, il legame del sito di adsorbimento, gp 120 con il CD4 dei linfociti T helper è essenziale, ma non sufficiente a garantire l’ingresso del virus: è infatti necessaria la presenza di un cofattore cellulare, identificato nella molecola CD26. Inoltre la gp 41, la proteina idrofobica che àncora la gp 12O all’envelope, è responsabile della fusione delle membrane dopo il legame del virus con la superficie cellulare. Altri retrovirus sembrano invece entrare nelle cellule mediante endocitosi.

RETROVIRIDAE: ssRNA, diploide (5’) R-U5 gag poli env U3 (3’) Trascrittasi inversa (DNA polimerasi-RNA dipendente):  Sintesi di una singola catena di DNA sullo stampo dell’RNA genomico (DNA polimerasi-RNA dipendente)  Rimozione, per digestione enzimatica dell’RNA stampo (ribonucleasi H)  Sintesi della catena complementare di DNA (DNA polimerasi-DNA dipendente) Formazione degli LTRs durante questo processo determinate dalle sequenze U5 e U3

Prodotto il dsDNA è trasportato nel nucleo, sotto forma di molecole circolari  Integrasi  Provirus  Dopo periodo di Latenza  Trascrizione geni virali RNA polimerasi II cellulare  RNAm  gag e pol  RNAm  env Proteine strutturali Molecole di RNA Proteine interne del virione si muovono verso la membrana cellulare modificata Assemblaggio rilascio

Pathways of Multiplication for RNA-Containing Viruses

Multiplication of DNA Virus 1. Virion attaches to host cell 2. Virion penetrates cell and its DNA is uncoated 3. Early transcription and translation; enzymes are synthesized 4. Early transcription and translation; enzymes are synthesized 5. Late translation; capsid proteins are synthesized 6. Virions mature 7. Virions are released

Gene expression is carried out by viral enzymes associated with the core and is divided into 2 phases: Early genes: ~50% genome, expressed before genome replication. These include growth factors, immune defense molecules, enzymes including those involved in DNA replication. Intermediate genes: are expressed giving rise to late transcription factors. Intermediate gene expression may not be possible in virion RNA because of steric inaccessibility to the RNA polymerase or the presence of nucleoid proteins. Late genes are only expressed after genome replication; late promoters are dependent on DNA replication for activity. Virion structural proteins are then made. The concatemeric DNA structures are resolved in an uncertain fashion and virion particles formed. Intracellular particles carry a Golgi derived envelope. Upon budding they acquire a second envelope from the cell plasma membrane.

Lo svestimento avviene in due fasi: - enzimi cellulari digeriscono lo strato esterno - la liberazione del core avviene a opera di prodotti virali Pox Viruses: Large viruses, visible by light microscopy ( kb) ds DNA. All pox genomes have inverted terminal repeat sequences (ITRs) at the ends of the genome in an opposite orientation. Contains in excess of 200 genes. At least 10 genes involved in genome replication. Particles contain upwards of 100 proteins. Most of the essential genes are located in the central part of the genome, while non-essential genes are located at the ends.

Fusione dell’envelope con la membrana cellulare Avviene in quei virus (paramyxovirus, herpesvirus) che possiedono una proteina specifica, denominata proteina F, in grado di modificare l’envelope stesso nel punto in cui avverrà la fusione. In Vaccinia virus è stata identificata una proteina di fusione che interviene sia al momento della penetrazione (e funziona sia a pH neutro, sia a pH acido), sia nell’induzione della fusione in cellule infette (che avviene sempre a pH neutro). Il fatto che questa proteina possa funzionare a condizioni di pH diverse, suggerisce che l’ingresso di questi virus possa avvenire sia per fusione dell’envelope con la membrana cellulare (pH neutro), sia dopo endocitosi (pH acido).

Virus a DNA – trascrizione di RNAm da un dsDNA e replicazione del DNA nel nucleo - traduzione dell’RNAm in proteine che avviene nel citoplasma utilizzando i ribosomi Alcuni virus, es. poxvirus e il virus della peste suina africana, si replicano interamente nel citoplasma – hanno la RNAm polimerasi-DNA dipendente

Clamidie - forma rotondeggiante - parete cellulare simile a gram-negativi (ma priva di acido muramico) - immobili - si moltiplicano nel citoplasma delle cellule ospiti con formazione di inclusioni vacuolari Coltivazione -Cellule di rivestimento del sacco vitellino di uova embrionate -Molte colture cellulari primarie e linee continue