LABORATORIO 2: ANALISI DI RESTRIZIONE DI DNA GENOMICO In questa esercitazione campioni di DNA (es.: da fago λ e da plasmide pET28) verranno digeriti con enzimi di restrizione. Il DNA digerito verrà poi caricato su un gel di agarosio ed i frammenti prodotti rivelati tramite osservazione alla luce UV

Tecnologia del DNA ricombinante Insieme di tecniche di manipolazione del DNA che consentono di isolare frammenti di tale molecola, moltiplicarli, sequenziarli, mutarli e combinarli con materiale genetico proveniente da fonti differente. Vettori di clonaggio ed espressione Enzimi di restrizione Enzimi dell’apparato di duplicazione ed espressione Elementi genetici Regolatori : PROMOTORI E OPERONI

Enzimi di restrizione  Sono stati evoluti dai batteri per proteggersi dalle infezioni virali  Endonucleasi= tagliano all’interno di filamenti di DNA  Sono noti più di 3000 enzimi Cosa sono gli enzimi di restrizione?

Sito di riconoscimento enzimatico Ogni enzima taglia il DNA ad una sequenza specifica = sito di restrizione Gli enzimi riconoscono sequenze palindromiche (eg GAATTC, EcoRI ) Sequenza Palindromica Sito di Restrizione Frammento1 Frammento 2

Enzimi di restrizione Tagliano le molecole di acidi nucleici riconoscendo brevi sequenze nucleotidiche a doppio filamento dette siti di restrizione

EcoRI – Escherichia coli – 5 prime overhang Pstl – Providencia stuartii – 3 prime overhang

Caratteristiche degli enzimi di restrizione La maggior parte degli enzimi di restrizione è stabile a bassa temperatura, e generalmente perde attività se viene riscaldato. Affinché gli enzimi di restrizione funzionino bene, bisogna seguire in laboratorio alcune regole:

Conservare gli enzimi a temperature tra i -10 ed i -20 °C. I congelatori no-frost possono generare salti di temperatura che possono danneggiare gli enzimi. Esistono contenitori termici che stabilizzano la temperatura e quindi sono in grado di preservare l’attività enzimatica Quando si ha un batch di enzima, bisogna fare delle aliquote di μl che permettono di evitare scongelamenti ripetuti della stessa proteina. Mantenere sempre gli enzimi in ghiaccio durante le procedure di preparazione dei campioni e rimettere a congelare immediatamente al termine Preparare le miscele di reazione in ghiaccio, poiché l’enzima inizia ad inattivarsi a T ambiente

Tamponi Ogni enzima di restrizione ha generalmente un tampone ottimale per il suo funzionamento, tuttavia si possono usare dei tamponi universali (per gruppi di enzimi) che permettono di poter utilizzare anche più di un enzima contemporaneamente. I tamponi vengono in genere forniti ad una concentrazione 10X. Se si deve fare un volume finale di 10 ml, ad esempio, sarà quindi necessario diluire 10 volte l’enzima, cioè aggiungere 1 ml di enzima (10X) alla miscela finale. Se si vogliono evitare troppe pipettate, meglio avere uno stock di enzima 2X, da diluire a metà.

Materiali necessari per l’esperienza

La quantità di enzima di restrizione presente in una confezione commerciale è espressa in unità. 1U=quantità di enzima necessaria per la digestione di 1  g di DNA in 1 ora. A queste concentrazioni tuttavia è di solito necessario incubare a lungo (anche tutta la notte). Pertanto è preferibile aggiungere enzima in abbondanza se i tempi di incubazione sono brevi (20-30’ in questo caso), o se i tamponi usati non sono quelli ottimali. Inoltre si compensa una certa perdita di attività in seguito a denaturazione. Ad esempio nella procedura riportata a lato, partendo da enzimi stock di 20U/  l e partendo da uno stock di DNA pari a 0,1  g/  l si avrà: 0.4  g tot. di DNA e 20U di enzima, cioè un rapporto DNA/enzima=1:80.

Assemblaggio del gel (0.8-1% agarosio) La procedura di assemblaggio della vaschetta e la posa in sede del gel di agarosio verranno illustrate ed eseguite dal personale di laboratorio (n.b. attenzione al Bromuro di etidio!!!)

Caricamento del gel elettroforetico La bontà della procedura di formazione dei pozzetti nel gel si riflette nella definizione delle bande.

Dopo il caricamento il gel viene fatto correre per circa minuti a mA Il gel alla fine della corsa verrà osservato su un trans-illuminatore a raggi UV, e le bande identificate comparate con quelle dello standard riportato qui sotto. Se possibile, misurare la distanza percorsa da ogni singolo frammento e riportare su grafico la distanza di migrazione (x) vs. il log bp (y). Usare come standard il pattern di HindIII oppure dei marcatori noti. Estrapolare dal grafico le dimensioni dei frammenti generati dagli altri enzimi di restrizione.

Sulla base dei risultati ottenuti, ricostruire una mappa del DNA del fago.

Esempi di elettroforesi venute “male” per motivi tecnici.